腺病毒fiber-TRAIL融合蛋白的构建和抗肿瘤活性研究

发布时间：2018-11-01 11:32

【摘要】：理想的肿瘤治疗方案旨在选择性的杀伤肿瘤细胞。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是TNF超家族一员,具有广谱的抗肿瘤功能,且其对于正常组织和细胞几乎无毒,因此近年来作为一种新型靶向抗肿瘤分子得到了广泛的研究和应用。临床研究显示,重组可溶性TRAIL蛋白毒副作用低、无免疫原性,在肿瘤的靶向治疗方面具有良好应用前景。然而研究表明,重组TRAIL的活性依赖其同源三聚体状态,且仅通过三聚体中心的Zn2+与各个单体上的半胱氨酸通过螯合作用维持。重组可溶性TRAIL本身半衰期较短、稳定性差、生物活性不强,并且有研究表明引入标签后会影响三聚体结构秩序从而产生肝毒性。这些缺点制约了其进一步的临床应用。因此,设计一种稳定的,低毒性的TRAIL衍生物或TRAIL融合蛋白有望较好地解决重组TRAIL目前存在的问题,有利于其临床研究和应用。Fiber蛋白是腺病毒表面的同源三聚体形式的纤毛蛋白,由基底蛋白tail,螺旋结构的shaft和结头蛋白knob组成。前期的研究表明,在shaft临近C端的2个或2个以上螺旋结构可以促进knob三聚体的形成。另外有报道称,带有tail结构的截短型shaft能够作为三聚体基序促进其它三聚形式的蛋白折叠。而通过结构分析我们发现,TRAIL三聚体与knob三聚体的三维结构十分相似。基于这些序列和结构的理论基础,我们选择利用腺病毒的fiber三聚体与可溶性TRAIL融合表达,设计并在原核体系表达了三种全新的重组可溶性TRAIL(soluble TRAIL,s TR)融合蛋白:禽类1型腺病毒的fiber:fowl Ad1 fiber s TR(FA1FT),人5型腺病毒的fiber:human Ad5 fiber s TR(HA5FT)和human Ad5 shaft s TR(HA5ST)。希望利用外源的三聚体来维持TRAIL活性三聚体构象,不完全依赖于Zn2+螯合作用,同时选择截短型的shaft,避免造成shaft引起的肝靶向作用。在获得纯化后的s TR蛋白后,切去多聚组氨酸,以排除标签带来的肝毒性,然后在s TR样品中加入Zn Cl2维持其三聚体结构状态,另外在各组蛋白样品中均加入DTT以避免高聚物的形成。最后用HPLC测定s TR、FA1FT、HA5FT和HA5ST蛋白的三聚体纯度。在体外检测中,我们选取本实验室存有的多种肿瘤细胞系(包括人乳腺癌细胞、人肝癌细胞、人宫颈癌细胞和人肺癌细胞等)检测重组TRAIL蛋白的体外杀伤活性,以及对正常组织细胞系的毒性作用。结果发现s TR、FA1FT和HA5ST都能够不同程度的杀伤肿瘤细胞,而HA5FT的杀伤作用并不显著,推测原因可能是融合HA5F结构域对TRAIL三聚体产生了空间位阻,使TRAIL的三聚体构象发生变化,不能够与其死亡受体有效结合,在本论文后续的实验中不再使用。通过caspase活力检测、流式细胞术和DAPI染色方法确定重组蛋白对肿瘤细胞的杀伤作用是通过凋亡途径实现的。然后将s TR、FA1FT和HA5ST在4℃和37℃的PBS或37℃血浆的体系中放置不同时间,评价各组蛋白体外稳定性。结果显示,融合表达的FA1FT和HA5ST对肿瘤细胞的杀伤能力及其稳定性与s TR相比都有显著的提升,并且我们认为,蛋白活性的增强归因于稳定性的提升。在体内研究实验中,我们建立了乳腺癌荷瘤裸鼠模型,通过注射不同剂量和不同途径比较s TR、FA1FT和HA5ST的体内抗肿瘤活性。进而分析药代动力学及蛋白的组织分布来评价体内代谢稳定性。结果发现HA5ST在体内的半衰期在6小时以上,远远高于天然状态的s TR(30min),这种代谢稳定性的提升使得HA5ST的抗肿瘤能力大大提高,即使在低剂量的治疗中,也有6/10裸鼠的肿瘤被完全清除。出乎我们意料的是,静脉注射及腹腔注射FA1FT的抗肿瘤能力并不理想,而在原位治疗中FA1FT表现出较好的抑瘤效果。药代动力学及体内分布实验发现,FA1FT在肝脏大量聚集,导致其不能够有效的靶向肿瘤组织,这可能是因为融合的三聚体基序包含了全部的shaft结构。体内毒性检测结果表明,s TR、FA1FT和HA5ST都不会造成肝肾损伤。通过本论文的研究得出如下,选择腺病毒shaft C端的1-2个螺旋结构与TRAIL融合表达是科学合理的,既可以安全有效地提高三聚体结构稳定性和抗肿瘤活性,又不会造成肝、肾损伤。本论文的研究为重组TRAIL的应用提供了新的思路,也为后续的临床前研究奠定良好的基础。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5

【参考文献】