人气道胰蛋白酶样蛋白酶4在急性髓细胞性白血病中的研究

发布时间：2018-11-01 18:00

【摘要】：第一章:HATL4在急性髓细胞性白血病中的表达及预后相关性研究目的:II型跨膜丝氨酸蛋白酶(Type II transmembrane serine proteases,TTSPs)是一类通过氨基末端跨膜区域锚定在细胞膜上的丝氨酸蛋白酶。人类TTSPs共有17个成员,在生理及病理过程中起着广泛而重要的作用,其功能异常导致癌症、缺铁性贫血、高血压、耳聋等。许多研究证实TTSPs与实体肿瘤的发生发展关系密切。我们实验室对TTSPs在恶性血液疾病中的作用开展了相关研究。基于前期研究结果,我们发现人气道胰蛋白酶样蛋白酶4(Human airway trypsin-like protease 4,HATL4)分子在急性髓细胞性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)患者骨髓细胞中异常表达。在本研究中,我们以HATL4作为重点研究对象,深入探讨该分子在AML发生发展中的作用及潜在机制,以及成为疾病诊断、预后指标或治疗靶点的可行性。为进一步研究TTSPs的功能以及它们在血液恶性肿瘤中的作用提供依据,也为TTSPs在肿瘤中的研究拓宽新的角度和视野。研究方法:1.收集恶性血液疾病患者骨髓标本,分离骨髓中的白细胞用于以下各种实验。2.利用逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription PCR,RT-PCR)和实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)对人恶性血液病细胞系和患者骨髓细胞中HATL4 m RNA的表达进行分析。3.采用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测恶性血液病细胞系和白血病患者骨髓细胞中HATL4蛋白的表达。4.使用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)和免疫荧光染色检测正常人外周血(Normal peripheral blood,NPB)白细胞和AML细胞系THP-1及AML患者骨髓细胞中HATL4蛋白的表达与定位。5.利用q RT-PCR检测AML患者治疗后骨髓细胞中HATL4 m RNA的表达并分析其与临床参数的相关性。研究结果:1.HATL4 m RNA在AML来源细胞系(HEL、SHI-1和THP-1)和慢性粒细胞性白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)来源细胞系(KU-812、MEG-01和K562)中表达,而在其它恶性血液病细胞系中不表达。另外,HATL4 m RNA在AML患者骨髓细胞中异常氋表达,而在正常人外周血、骨髓和其他白血病如CML、急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)、CLL(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)患者骨髓细胞中检测不到。2.Western blotting结果显示HATL4在AML患者骨髓细胞中异常表达,而在其它白血病患者骨髓细胞中未检测到HATL4蛋白的表达,与m RNA表达结果一致。3.流式细胞术发现HATL4蛋白表达于AML患者骨髓细胞的粒细胞和单核细胞表面上,阳性率均为100%,不表达于NPB细胞及T或B淋巴细胞表面上。免疫荧光染色证实,HATL4定位于THP-1和AML骨髓细胞的膜表面。4.在105例治疗后AML病人骨髓标本中,HATL4 m RNA阳性19例,阴性86例。基于美国国立综合癌症网络实践指南分级,HATL4表达阳性病人为预后等级差(47.37%)或中等(52.63%),而在表达阴性病人中,小部分(4.65%)是预后等级差,大部分是预后等级中等(69.77%)和良好(25.58%)。在相关性分析中,骨髓细胞HATL4 m RNA表达与患者微小残留病灶(Minimal residual disease,MRD)和预后等级相关,与其他参数如:年龄、性别、亚型等无显著相关性。Kaplan-Meier法分析显示,HATL4阳性病人无进展生存期显著短于阴性病人(p=0.0299)。结论:本章节研究发现,AML初诊患者骨髓细胞高表达HATL4 m RNA和蛋白,提示HATL4可能作为诊断AML新的生物标志物。此外,AML患者治疗后HATL4的表达与MRD和预后等级相关,HATL4表达水平越高,复发的可能性越大,预后等级越差。此外,HATL4表达阳性的患者无进展生存期明显缩短,预示HATL4阳性病人预后不良。因此,HATL4在AML患者骨髓细胞中的异常高表达,有望应用于AML的临床早期诊断、靶向治疗及预后评估。第二章:HATL4的肿瘤细胞生物学体外研究研究目的:在第一章中,我们发现HATL4在AML患者骨髓肿瘤细胞中异常高表达,并且该表达与AML病人预后不良相关。这些结果提示,HATL4在肿瘤细胞的异常表达可能与AML的病理过程相关。我们推测,HATL4的表达可能影响AML细胞的肿瘤生物学功能,从而参与AML的发生发展。因此,本研究中我们选用了内源性表达HATL4的急性髓系白血病细胞系THP-1作为研究对象,通过特异性沉默HATL4 m RNA的表达,在体外水平研究HATL4对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,探讨HATL4在AML细胞生物学中的作用及可能机制。研究方法:1.构建特异性干扰HATL4的sh RNA(Short hairpin RNA)慢病毒载体,利用磷酸钙沉淀法制备慢病毒,侵染AML系THP-1细胞,干扰HATL4 m RNA的表达,用q RT-PCR和Western blotting技术检测慢病毒干扰效率。2.用FCM检测对照组和干扰组中绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的阳性率,以THP-1细胞为阴性对照。3.以构建的HATL4-pc DNA3.1全长基因为模板,采用定点突变,构建HATL4突变体。利用瞬间高压电穿孔细胞膜,将HATL4突变体转入到已特异性沉默HATL4的细胞中,该突变体不能被sh RNA特异性沉默,从而在sh RNA干扰后的THP-1细胞中恢复HATL4的表达。4.通过流式分选(Flow sorting),用间接荧光染色法将上述电转化表达HATL4突变体的细胞分选出来。5.利用细胞增殖实验(Cell counting kit-8,CCK-8)检测特异性沉默HATL4m RNA表达后对THP-1细胞增殖能力的影响。6.采用细胞迁移实验(Transwell migration assay)检测HATL4表达下调后THP-1细胞迁移能力的改变。7.通过基底膜侵袭实验(Transwell Matrigel invasion assay)检测HATL4表达下调后THP-1细胞侵袭能力的改变。另外,在实验中加入基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)抑制剂GM6001,观察HATL4沉默前后THP-1细胞侵袭Matrigel能力的改变。8.收集HATL4沉默前后THP-1细胞的培养上清,通过明胶酶谱法分析HATL4表达水平高低对上清中MMP-2和MMP-9活性的影响。9.转染表达HATL4于中国仓鼠卵(Chinese hamster ovary,CHO)细胞膜上,研究HATL4对重组pro-MMP-2蛋白的活化,用MMP-2活性试剂盒检测上清,以此验证HATL4是否参与pro-MMP-2酶原的激活。研究结果:1.我们采用si RNA特异性沉默HATL4 m RNA的表达。用含sh H(包含特异性沉默HATL4的sh RNA核苷酸序列,命名为干扰组)和sh NC(以sh H序列为靶序列打乱的核苷酸序列,命名为对照组)目的质粒的病毒侵染THP-1细胞,培养72 h后,经过FCM检测细胞中GFP的阳性率(即病毒侵染效率)大于99%。再经q RT-PCR检测干扰组的HATL4 m RNA表达抑制率大约是70%,因此筛选到两组对照组(sh NC1和sh NC2)和干扰组(sh H1和sh H2)细胞。2.将构建的两个HATL4突变体,电转导入两个干扰组细胞(sh H1和sh H2)中,培养扩大后,间接荧光染色,经流式分选得到HATL4突变体表达阳性细胞(命名为恢复组,sh R1和sh R2)。然后分别用q RT-PCR和Western blotting检测HATL4m RNA和蛋白的表达。与对照组(sh NC1和sh NC2)相比,干扰组(sh H1和sh H2)细胞中,HATL4 m RNA和蛋白表达抑制率约70%。HATL4突变体重新表达的两个恢复组(sh R1和sh R2)细胞株中,HATL4 m RNA和蛋白的表达又恢复到对照组水平。结果表明sh RNA介导的HATL4沉默是特异的,这些细胞可用于后续的功能学研究。3.细胞增殖实验表明,特异性沉默HATL4表达以及沉默后又恢复HATL4表达对THP-1细胞的增殖能力没有明显改变。4.细胞迁移实验表明,降低HATL4表达对THP-1细胞的迁移能力没有明显改变。5.基底膜侵袭实验表明,抑制HATL4表达后,THP-1肿瘤细胞对Matrigel的侵袭能力显著降低。此外,加入MMP抑制剂GM6001明显降低对照组和干扰组细胞侵袭Matrigel的能力,说明HATL4增强THP-1细胞侵袭能力至少在一定程度上是通过MMPs介导的。6.Western blotting结果显示对照组、干扰组和恢复组THP-1细胞上清中pro-MMP-2总量基本相同,但明胶酶谱实验提示,干扰组细胞中活化的MMP-2(~62k Da)和MMP-9(~83 k Da)表达明显减弱,并且以活化的MMP-2条带减弱为主。这些结果提示,HATL4表达降低可能抑制MMP-2酶原的激活。7.检测到HATL4过表达的CHO细胞上清中MMP-2酶原的激活显著增强,提示HATL4可能是通过激活pro-MMP-2生成MMP-2发挥其蛋白水解功能,降解基底膜,增强肿瘤细胞的侵袭性。同时明胶酶谱实验也证实有活化的MMP-2生成。结论:在体外细胞实验中,HATL4的表达不改变AML来源的THP-1细胞的增殖和侵袭,但能增强AML来源的THP-1细胞侵袭Matrigel以及降解明胶的能力。我们的结果还提示,HATL4可能是主要通过激活pro-MMP-2,从而增强肿瘤细胞降解基底膜的侵袭能力。第三章:HATL4在小鼠肿瘤模型中的生物学研究研究目的:在第一章中,我们发现蛋白酶HATL4在AML细胞中异常高表达,而且HATL4的表达与AML病人治疗后预后不良相关,提示HATL4在AML的发病机制中起重要作用。在第二章中,我们发现HATL4能够增强AML来源的THP-1细胞侵袭Matrigel的能力。另外,我们通过明胶酶谱等实验发现HATL4可能是通过激活MMPs,尤其是MMP-2,从而促进细胞基底膜降解,增强肿瘤细胞的侵袭性。为了进一步证实我们的发现,在本章研究中,我们选用裸小鼠作为研究对象,将上述对照组、干扰组和恢复组细胞进行小鼠皮下荷瘤试验,观察成瘤大小,从体内水平来研究HATL4对肿瘤细胞增殖、凋亡和血管生成等能力的影响,探讨HATL4在AML发生发展中的作用及潜在机制。研究方法:1.将上述对照组、干扰组和恢复组THP-1细胞扩增培养后,皮下接种六周龄雄性裸小鼠后肢内侧,定期观察各组成瘤情况,测量肿瘤的长宽,计算肿瘤体积。2.用免疫组织化学法对瘤组织细胞进行Ki-67和CD34染色,分别检测瘤组织中细胞增殖和血管表达情况。3.通过脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL),对三组裸鼠肿瘤组织切片进行细胞凋亡检测。研究结果:1.接种第10天后,可以观察到裸小鼠后肢内侧肿瘤形成。第24天后,干扰组细胞(sh H1和sh H2)接种的小鼠肿瘤增长速度显著低于相应的其它两组。第36天后,小动物活体成像观测到荧光信号出现在肿瘤接种部位。在干扰组小鼠,肿瘤荧光信号较弱,且成瘤体积小,平均肿瘤体积和重量均明显小于其它两组。2.与相应的对照组和恢复组相比,干扰组小鼠肿瘤组织切片中Ki-67阳性细胞数明显减少。这一结果提示抑制HATL4的表达降低了THP-1细胞在小鼠体内的增殖能力。因此HATL4在体内可能通过促进THP-1细胞的侵润和增殖能力而发挥促肿瘤生长的效应。3.在三组裸鼠肿瘤组织切片中,计数各500个细胞中TUNEL阳性细胞数,统计结果显示三组阳性率没有显著性差异,提示干扰组的THP-1细胞在裸鼠瘤组织中细胞凋亡没有发生明显改变。因此,移植瘤在干扰组裸鼠体Qg生长速度减缓以及瘤体积的减小并不是由于细胞凋亡增加而引起的。4.用血管标记物CD34对瘤组织血管进行染色并统计,发现三组的瘤组织血管数量没有明显差异,提示HATL4的表达与否并不影响THP-1细胞移植瘤内血管的生成。因此,THP-1细胞在裸鼠体内的成瘤机制和生长速度与血管生成没有直接关系。结论:在裸鼠体内肿瘤模型中,HATL4可以促进THP-1来源的肿瘤细胞增殖,加快肿瘤生长速度。这一结果提示,HATL4可能参与AML的病理过程,促进AML的发生发展。总之,我们首次发现II型跨膜丝氨酸蛋白酶HATL4在AML初诊病人中异常高表达,提示HATL4可以成为一个诊断AML新的生物标志物。我们的结果也显示AML患者治疗后骨髓细胞中HATL4的表达与MRD和预后等级呈显著相关。因此,HATL4在AML骨髓细胞中的异常高表达,有望应用于AML的临床早期诊断、靶向治疗及预后评估。在HATL4的作用机制方面,我们发现HATL4能激活MMPs,特别是MMP-2,通过降解细胞外基质,促进肿瘤细胞的侵袭和生长而参与AML发生发展的病理过程。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.71
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本文编号：2304674