转运siRNA的肝靶向复合载体GA-PEG-PKAE-GO的研究

发布时间：2018-11-04 17:49

【摘要】：目的:肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,严重危害健康。近年来,在传统的放疗、化疗、手术治疗之外,又出现了以RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术为治疗手段的基因治疗。RNAi需要载体将作为药物的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)转入细胞,该过程称为转染。转染需要载体才能进行。以病毒为载体递送si RNA转染效率高,但存在免疫原性、致癌性等弊端;非病毒载体具有低毒性、低免疫原性、低致癌性、易制备、便于大规模生产等特点,但是转染效率要明显低于病毒载体,因此提高非病毒载体的转染效率是基因治疗的关键和基础,成为目前的研究热点。方法:本研究以氧化石墨烯为主体,制备了一种复合靶向si RNA载体GA-PEG-PKAE-GO,其中GO(graphene oxide,氧化石墨烯)为载体的主体结构;GA(glycyrrhetinic acid,甘草次酸)为肝靶向配体;PEG(polyethylene glycol,聚乙二醇)可提高复合物的血液循环时间;PKAE是一种高分子聚合物,能够以静电作用与si RNA结合,末端的芘基(pyrene group)可与GO通过π-π堆积结合。本研究也对其转运si RNA的功能进行了体内外评价。1.2,2-二甲氧基丙烷与2-丙烯酸羟乙酯发生缩酮交换反应,得到KDA,KDA与二亚乙基三胺发生氮杂迈克尔加成反应,生成PKAE;用酸碱滴定法测定PKAE的缓冲能力;用琼脂糖凝胶电泳测定PKAE在体外结合/释放si RNA的能力。2.通过EDC/NHS反应先后合成GA-PEG与GA-PEG-GO,PKAE与GA-PEG-GO通过π-π堆积作用非共价结合;测定GA-PEG-PKAE-GO的粒径、ζ-电位与多分散系数,考察GA-PEG-PKAE-GO的光热效应以及体外结合/释放si RNA的能力。3.以人肝癌细胞系Hep G2为实验对象,进行以下实验:采用MTT法测定GAPEG-PKAE-GO的细胞毒性;以FAM标记的si RNA为荧光标记,测定复合物的转染效率;采用钙黄绿素和Lyso Tracker Red双染法考察复合物的内吞体逃逸和si RNA的释放;用GA-PEG-PKAE-GO递送Bcl-2 si RNA,通过RT-PCR测定Bcl-2 m RNA的转录,并且通过Western Blotting法测定Bcl-2蛋白质的翻译,考察si RNA的基因沉默功效;采用MTT实验测定细胞毒性,并在Annexin V/PI双染色的基础上,观察该复合载体的诱导细胞凋亡功能。4.裸鼠体内植入人肝癌细胞Hep G2,以多柔比星为荧光标记,给予裸鼠GA-PEGPKAE-GO/多柔比星复合物,通过荧光分光光度法测定多柔比星在不同器官中的分布,考察复合靶向载体GA-PEG-PKAE-GO在不同器官组织中的分布状况。结果:1.合成了高分子聚合物PKAE;它在p H7.4条件下可以结合si RNA,在p H 5.4的酸性环境下能水解成小分子,释放si RNA。2.合成了复合靶向载体GA-PEG-PKAE-GO,其粒径为(266.1±101.8)nm,PDI为0.380,ζ-电位为(46.9±7.96)m V;在波长为808 nm、功率为0.25W的近红外线照射下,5分钟使液体温度上升3.8℃,显著高于对照组;它在p H7.4条件下可以结合si RNA,在p H 5.4的酸性环境下,与si RNA结合的PKAE模块能水解成小分子,释放si RNA。3.MTT实验表明,给予复合靶向载体GA-PEG-PKAE-GO的各个实验组的细胞活力与对照组没有显著的差异。转染效率试验显示,GA-PEG-PKAE-GO可以将FAM-si RNA转入细胞,GA-PEG-PKAE-GO组的荧光强度以及发射荧光的细胞数量均高于对照组(Lipofectamine 2000),808 nm近红外激光照射的GA-PEG-PKAE-GO组的荧光强度以及发射荧光的细胞数量高于GA-PEG-PKAE-GO组。内吞体逃逸试验显示,GA-PEGPKAE-GO所携带的si RNA发射的绿荧光与Lyso-Tracker Red所标记的内吞体/溶酶体发射的红色荧光基本重合;随着时间的延长,红色荧光逐渐减弱,绿色荧光在胞内扩散,表明GA-PEG-PKAE-GO在内吞体中酸性环境下打破了内吞体并将si RNA释放到细胞质中。RT-PCR实验和Western Blotting实验分别显示,在转染Bcl-2 si RNA之后,m RNA的转录水平和Bcl-2蛋白质翻译水平明显降低。MTT实验显示,在转染Bcl-2 si RNA之后,Hep G2细胞的活力显著下降。流式细胞分析显示,在转染Bcl-2si RNA之后,Hep G2细胞出现了明显的凋亡。4.组织分布实验显示,复合靶向载体GA-PEG-PKAE-GO在裸鼠肝脏和肿瘤组织中的分布显著超过其他器官。结论:复合靶向载体GA-PEG-PKAE-GO能够在体内靶向运输si RNA,顺利地转染si RNA,在胞内释放si RNA,并且保证si RNA在胞内发挥作用,具有较好的应用前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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本文编号：2310672