血清miRNA作为非小细胞肺癌诊断标志物的研究

发布时间：2018-11-07 07:07

【摘要】：肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,大部分的肺癌患者到了晚期才被发现。早期发现并加以干预可提高肺癌患者的生存时间,因而临床亟需寻找一种具有较高敏感度和特异度的诊断方法。近年来有文献报道miRNA可以作为非小细胞肺癌的一个潜在的诊断标志物,本研究旨在发现血清中异常表达的miRNA并能够用以辅助诊断,另外,我们对其中一个miRNA, miR-660进行了进一步的功能研究。我们选取了44例非小细胞肺癌患者和22例正常对照血清样本用以筛选非小细胞肺癌患者中异常表达的miRNA,另外我们选取了300例血清样本,包括178例非小细胞肺癌患者和122例正常对照用来对发现的miRNA进行验证。这300例样本按照肺癌和正常对照分别随机分为两组,一组作为训练组用来建立miRNA的诊断模型,一组作为验证组用来验证诊断模型。在发现阶段,我们选取了380个miRNA,通过TaqMan(?) miRNA ABC Purification试剂盒进行了miRNA的提取,采用实时荧光定量PCR的方法对miRNA的表达水平进行了检测。结果发现miR-194、miR-652和miR-660在非小细胞肺癌患者血清中高表达,并且其中的一个miRNA、miR-660在20对非小细胞肺癌组织中的表达水平也高于相应的癌旁组织,可以推测血清miR-660可能来源于肺癌组织。在发现阶段,3个miRNA (miR-194、miR-652和miR-660)被证实在非小细胞肺癌患者血清中高表达,之后通过大样本的验证发现miR-652和miR-660在肺腺癌和肺鳞癌中表达水平都有一定的提高(p0.01)。之后我们通过ROC曲线对miR-652和miR-660的诊断效率进行了评价,结果发现miR-652在训练组和验证组的曲线下面积分别为0.819(95% CI：0.749-0.877)和0.819(95% CI：0.747-0.877),miR-660的曲线下面积为：训练组：0.735(95% CI：0.657-0.803)；验证组：0.714(95% CI：0.634-0.785)。由于单个的miRNA的诊断效率还不是很高,我们将miR-652和miR-660通过二元logistic回归方程进行了组合,结果发现组合后的模型对非小细胞肺癌(肺腺癌和肺鳞癌)的诊断效率要优于单独的miR-660的诊断效率(p0.05)。在此基础上,我们将该组合和临床使用的肿瘤标志物进行了比较,结果发现miR-652和miR-660的组合在训练组和验证组中对非小细胞肺癌(肺腺癌和肺鳞癌)的诊断效率均要优于CEA和CA125(p0.05)。然而,Cyfra21-1对非小细胞肺癌(肺腺癌和肺鳞癌)的诊断效率与miR-652+miR-660的组合相差无几。因此,我们将miR-652+miR-660与这三个肿瘤标志物进行了随机组合并计算了各个组合对非小细胞肺癌(肺腺癌和肺鳞癌)的诊断效率,结果发现niR-652+miR-660+Cyfra21-1为最优组合,该组合能够显著提高肺腺癌的诊断效率,训练组的曲线下面积为0.941(95% CI：0.881-0.977),验证组的曲线下面积为0.942(95% CI：0.881-0.977)。但是对于肺鳞癌,miR-652+miR-660+Cyfra21-1组合的诊断效率依然和Cyfra21-1没有显著的统计学差异。由于miR-660在非小细胞肺癌中的功能研究甚少,我们选择了miR-660进行进一步的功能学研究,通过瞬时转染miR-660的抑制剂,发现miR-660表达水平的降低能够抑制肺癌细胞系Anip973的侵袭、迁移和增殖能力。抑制miR-660的表达水平能够诱导细胞周期G2/M的阻滞进而影响细胞的增殖。之后我们使用生物信息学方法对miR-660的下游靶基因进行了分析,发现PCDH9的3'UTR可以和miR-660的种子序列互补结合。PCDH9是原钙粘蛋白超家族的一个成员,其在不同的肿瘤组织中的表达水平均低于癌旁组织。我们的研究结果发现非小细胞肺癌组织中miR-660水平的降低会导致PCDH9的表达水平的升高,即miR-660和PCDH9的表达水平呈负相关。以上结果说明miR-660的表达水平升高能够通过抑制PCDH9的表达进而促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。综上所述,miR-652+miR-660+Cyfra21-1的组合可以作为非小细胞肺癌的一个新的标志物用于肺癌的辅助诊断,尤其对肺腺癌的诊断效率更好。其中miR-660可能会通过影响PCDH9蛋白的表达来影响细胞的表型,说明miR-660可能在肺癌的发展中发挥重要的作用,可以对其进行更为深入的研究。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2

【参考文献】