FSTL1在肾癌发生发展中的作用及其机制研究

发布时间：2018-11-08 18:26

【摘要】：[背景]肾细胞癌(Renal cell carcinoma, RCC)是最常见的泌尿系恶性肿瘤之一。由于RCC对放化疗不敏感,免疫治疗的疗效有限,靶向治疗显示出一定前景,但存在个体差异,因此晚期RCC患者和转移的RCC患者预后差,五年生存率不到10%。以上究其根本原因是RCC的发生发展机制尚不明确。众多证据表明,NF-κB炎症信号通路在肾癌中处于持续激活状态。我们前期应用Microarray的方法发现卵泡抑素样蛋白1 (Follistatin-like protein 1, FSTL1)可能与RCC转移相关,且RCC中FSTL1的转录水平由癌旁正常组织、原位癌组织到转移癌组织,呈现逐渐降低的趋势,提示其可能发挥抑癌基因的作用。FSTL1是一种由非免疫细胞表达分泌的炎症相关蛋白。本研究拟结合宏观人群研究和微观分子水平两方面,探讨FSTL1基因的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)、基因表达与RCC发生发展的关系及临床意义,由此为丰富RCC发生发展机制,寻找新的治疗靶点和预后标志物提供科学依据。[材料与方法]1.采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)和免疫组化的方法检测FSTL1在肾癌细胞(786-0, ACHN及我室自行建立的汉族人肾癌细胞株NRCC)和95例临床组织样本中的表达分布特点,及其与肾癌肿瘤分期的相关性。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,评价FSTL1蛋白表达在肾癌预后预测中的价值。2.通过检索国际人类基因组单体型图计划,采用Haploview软件搜索FSTL1相关的标签SNP位点。采用流行病学病例对照研究方法、应用Taqman探针-实时定量PCR法对FSTL1相关SNP位点(rs11708686, rs2673704, rs1259293, rs1402372, rs1105219, rs1259339)在417例肾癌样本和855例正常对照样本中进行分型检测,使用在线分析工具(http://ihg.gsf.de)检验任意SNP在对照组中的基因分型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用Logistic回归分析FSTL1相关SNP与肾癌发病的相关性,使用Kaplan-Meier分析FSTL1相关SNP的基因型与预后的关系。3.构建FSTL1真核表达载体和特异性沉默FSTL1的shRNA载体,转染至肾癌细胞株(786-O、ACHN、 NRCC)中,观察过表达和沉默效果；通过软琼脂克隆实验、Transwell细胞侵袭实验、流式细胞术、RT-PCR等方法考察FSTL1基因对RCC细胞表型和生物学行为的影响。4.采用cDNA表达谱芯片分析NRCC中沉默FSTL1后的基因表达变化,采用DIVID分析法和GSEA分析法分别对差异表达基因进行通路富集和功能预测,并采用RT-PCR、Western Blot,报告基因对上述预测到的FSTL1参与的信号转导途径进行验证。5.体外模拟肿瘤炎性缺氧的微环境,通过RT-PCR、Western Blot对FSTL1下游相关通路间的交互作用进行考察,寻找下游交叉节点分子。利用免疫共沉淀、质谱鉴定,筛选介导相互作用的候选分子。[结果]1.与人正常胚胎肾上皮细胞293T相比,FSTL1在肾癌细胞(ACHN.MRCC和NRCC)中低表达(p0.05),在肾癌细胞786-0中高表达(p0.05)。免疫组化分析显示FSTL1蛋白在癌组织中的表达水平显著低于配对的癌旁正常组织(p0.001)；癌组织中FSTL1蛋白表达量与肿瘤分期呈负相关(p=0.013,r=-0.264)。肾癌组织中FSTL1表达为阴性的患者术后平均生存时间97.22个月,癌组织中FSTL1表达为阳性的肾癌患者术后平均生存时间115.84个月(Log-rank检验p=0.138)。2.在正常对照组样本中,六个基因多态性位点的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(p0.05)。以肾癌患者为病例组,携带rs1259293位点CC基因型者较TT基因型其肾癌发病风险升高(OR=2.004,95%CI=1.190-3.375, p=0.009);以RCC的主要病例类型——肾透明细胞癌患者为病例组获得相似结论(OR=2.014,95%CI=1.171-3.463, p=0.011),提示rs1259293位点CC基因型为肾癌发生的危险因素。本研究中未发现rs11708686, rs1105219, rs1259339, rs1402372和rs2673704与RCC危险性之间的统计学关联。携带rs 1259293 TT/CT基因型的RCC患者平均术后总生存期为129.17个月,显著高于携带CC基因型的RCC患者的平均术后总生存期79.63个月(p=0.022)。3.在稳定沉默FSTL1的NRCC细胞中,与对照NRCC shsiscramble细胞相比,NRCC shFSTL1-2的克隆形成能力、迁移侵袭能力显著升高,NRCC shFSTL1-1/2的N-cadherin表达量显著上升(p0.01), E-cadherin表达量显著下降(p0.01)。ACHN、786-0也获得相似的结论。NRCC中沉默FSTL1后,G0/G1期细胞数减少,S期和G2/M期细胞数增多；细胞表面标志物CD99、 N-cadherin、EpCAM表达增多,CD24表达减少。以上结果提示,过表达FSTL1能够抑制肿瘤的生长、增殖,迁移和侵袭；沉默FSTL1后能够促进肾癌细胞生长,增殖,迁移和侵袭,促进细胞由G1期进入S期,RCC细胞粘附水平降低,启动上皮间质转化(EMT)过程。4. Affymetrix Human U133 Plus 2.0表达谱芯片数据分析显示,沉默FSTL1表达后NRCC shFSTL1-1/2细胞中共有105个差异表达基因(48个共同表达下调和57个共同表达上调)。以富集错判率小于25%为标准,应用GSEA软件分析发现FSTL1沉默的NRCC细胞中共有12个功能基因亚集表达下调和23个功能基因亚集表达上调,包括TNFα、NF-κB、HIF1α和HIF2α相关功能基因亚集显著性富集且上调表达。ACHN、786-O和NRCC细胞沉默FSTL1后IL-6和HIF1α的转录水平显著上升(p0.05); ACHN和786-0细胞中过表达FSTL1后,HIF1α的转录水平显著下降(p0.05),IL-6的转录水平未见显著变化。Western blot结果显示,TNFα刺激30分钟时,与对照组NRCC shsiscramble相比,NRCC shFSTL1-1/2组细胞中Iκ-Bα表达量显著降低,提示沉默FSTL1表达后NF-κB信号通路活性升高。NF-κB报告基因分析发现,在ACHN和786-0中沉默FSTL1后,NF-κB转录活性升高,而过表达FSTL1后,NF-κB转录活性降低,以上结果提示FSTL1可能通过抑制NF-κB信号途径和HIF信号途径发挥抑癌作用。5.采用DFX和TNFα刺激模拟肿瘤生长的缺氧／炎性环境,结果发现DFX刺激后,786-0和ACHN细胞中IL-6转录水平显著升高(p0.05)；TNFα刺激后,ACHN细胞中HIF通路下游基因PGK1表达水平升高(p0.01)。Western blot检测结果提示,加入DFX刺激后,ACHN、MRCC和NRCC细胞中Iκ-Bα表达量降低,NF-κB通路活性增强,加入TNFα后,786-O、ACHN和MRCC细胞中,HIF2α表达量升高,HIF信号途径活性增强,并且无论单独加入DFX或TNFα,或两者共同处理细胞,786-O、MRCC和NRCC中pAkt和pGSK表达量均升高。以上结果提示,肾癌细胞中FSTL1的下游通路HIF和NF-κB信号途径存在交叉调节情况,均可激活PI3K信号通路。利用免疫共沉淀、质谱鉴定,发现CDC24、等分子可能参与HIF与CDC24、TUBB、CCT3途径的交互作用导致的PI3K通路活性增强。[结论]RCC患者癌组织中NF-κB的表达水平较癌旁正常组织显著下调,且癌组织中FSTL1表达水平与病理分期呈负向相关。首次发现FSTL1基因rs1259293位点多态性与RCC发病有关,CC基因型为RCC发病的危险因素,且CC基因型与RCC患者预后不良相关。过表达FSTL1能够抑制肿瘤的生长、增殖,迁移和侵袭；沉默FSTL1后能够促进肾癌细胞生长,增殖,迁移和侵袭,促进细胞由G1期进入S期,启动EMT转化过程。FSTL1可通过抑制NF-κB信号通路和HIF信号通路活性在RCC恶性进展中发挥抑癌作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.11

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