汉防己碱联合植入用缓释氟尿嘧啶对胃癌细胞原位移植615小鼠的治疗效果及机制研究

发布时间：2018-11-09 12:45

【摘要】：目的：胃癌是当今社会常见的消化道恶性肿瘤,其发病率及死亡率呈逐渐上升的趋势。目前,国内进展期胃癌5年生存率相对较低,不足30%。其主要原因是在治疗过程中,胃癌细胞对临床使用的化疗药物产生较强大的耐药性,治疗效果不佳。肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance,MDR)是导致化疗失败的根本原因。随着现代医学技术的发展,国内外学者广泛认为P-糖蛋白抑制剂可以逆转肿瘤的耐药性；药物汉防己碱Tet能够逆转肿瘤细胞的多药耐药(MDR),但作用机制尚需进一步研究。缓释氟尿嘧啶植入剂能够提高化疗药物的局部浓度,增加化疗效应,减少不良反应的发生。本实验我们将采用荧光定量RT-PCR法、免疫组化技术,研究探讨汉防己碱联合植入用缓释氟尿嘧啶对胃癌细胞原位移植小鼠肿瘤细胞的抑制作用,为临床胃癌的个体化治疗及肿瘤细胞多药耐药MDR逆转提供实验及理论依据。方法：1动物模型采用胃癌肿瘤细胞原位移植方法进行复制。复苏的MFC细胞进行传代培养,选择生长良好的肿瘤细胞种植到615小鼠后背的皮下,进行逐次传代,6次传代以后,再将肿瘤实体瘤块种植到615小鼠的胃壁表面,这样50只615小鼠原位移植胃癌模型就予以成功建立。250只615小鼠胃癌细胞原位移植成功造模以后,随机分成五组,每组10只小鼠。造模成功以后,开始给予实验药物干预。对照组：生理盐水腹腔注射；5-氟尿嘧啶组(5-FU组)：给予实验干预药物5-氟尿嘧啶,剂量50mg/Kg,给药方式腹腔注射,频率每6天给药一次；汉防己碱组(Tet组)：实验干预药物汉防己碱,剂量15mg/Kg,给药方式腹腔注射,频率每3天给药一次；植入用缓释氟尿嘧啶组(FSRI组)：实验干预药物植入用缓释氟尿嘧啶,剂量6mmg/只,给药方式瘤旁植入缝合切口,频率给药一次；汉防己碱+植入用缓释氟尿嘧啶组(Tet+FSRI组)：实验干预药物汉防己碱+植入用缓释氟尿嘧啶剂量及给药方式汉防己碱15mg/Kg进行腹腔注射,同时手术切开肿瘤处皮肤,肿瘤旁植入植入用缓释氟尿嘧啶,剂量6mmg/只,频率汉防己碱每3天给药一次,植入用缓释氟尿嘧啶给药一次。三周以后,称重肿瘤结节重量,瘤重抑制率=(对照组的平均瘤重一实验组的平均瘤重)／对照组的平均瘤重×100%。3采用荧光定量RT-PCR方法检测各组胃癌组织MDR1、Survivin mRNA的表达。4采用免疫组织化学法检测各组(对照组、5-FU组、Tet组、FSRI组和Tet+FSRI组)胃癌组织P-gp、Survivin蛋白的表达。5用SPSS 17.0统计分析软件进行统计学分析。数据用均数士标准差(x±s)表示,计量资料先进行方差齐性检验后,行单因素方差分析(One-Way ANOVE),用SNK法进行两两比较,免疫组织化学阳性率比较采用X2检验的方法,P0.05才为有统计学意义。方法：1复制615小鼠皮下移植瘤及原位移植瘤模型将小鼠前胃癌细胞株MFC皮下移植第一代2只615小鼠,于小鼠背部接种MFC细胞悬液,待肿瘤逐渐增大至10mm直径时,进行传代。取传代六次后的皮下移植瘤组织实块,进行小鼠原位移植。大约8-9天后,原位移植动物小鼠模型左上腹部可触及大约直径约4mm左右的硬结,提示原位移植瘤造模成功。50只小鼠全部造模成功。2各组前胃癌细胞原位移植615小鼠的行为状况变化差别比较对照组,615小鼠随着移植瘤结节的逐渐增大,其精神越来越差,进食、水逐渐减少,体重逐渐减轻,活动减少,反应迟钝,存在恶液质表现。5-Fu组、Tet组及FSRI组,发现各组小鼠均有不同程度的食欲减退、体重减轻、活动减少、反应迟钝等表现。而Tet+FSRI组,该组小鼠相对其他实验组小鼠相比,一般情况相对较好,正常进食水,伴有轻度呕吐,体重无明显变化,反应较灵敏等表现。3各组原位移植小鼠移植瘤体积的比较实验结束取瘤时对照组,5-FU组、Tet组、FSRI组、Tet+FSRI组小鼠的体积分别为881.50±59.57mm3,701.80±87.18mm3,399.40± 67.53mm3, 342.60±50.45 mm3,89.60±13.11 mm3;5组比较有统计学差异(P0.05)。5-FU组、Tet组、FSRI组平均肿瘤体积大小显著小于对照组(P0.05),Tet组及FSRI组平均肿瘤体积大小则无明显差异性,但均明显低于5-FU组(P0.05)。Tet+FSRI组平均肿瘤体积最小(P0.05)。4移植瘤的形态学特点肿瘤呈实体表现,表面凹凸不平,包膜不光滑,与周围组织界限不清。对照组,原位移植瘤的瘤体切面呈灰白色,中央瘤体未见明显坏死；在光学显微镜下可以观察到散在斑点状坏死病灶。5-FU、Tet组、FSRI组、Tet+FSRI组,原位移植瘤的瘤体切面也呈灰白色,没有光泽,中央瘤体能看到大小不等的散在坏死灶,边缘部位可发现散在的残余肿瘤。光学显微镜下,瘤体中心发现大片细胞坏死的表现,其内残留部分可见尚木完全坏死的肿瘤细胞。细胞体积大小不等,细胞核多见异型改变。5各组小鼠移植瘤瘤重及瘤重抑制率的比较实验结束后取瘤时对照组,5-FU组、Tet组、FSRI组、Tet+FSRI组的瘤重分别为2.16±0.12g,1.93±0.35g,1.86±0.24g,1.84±0.17g,1.27±0.21g；5-FU组、Tet组、FSRI组、Tet+FSRI组瘤重抑制率分别为10.64%,13.88%,14.81%,41.20%;5-FU组、Tet组、FSRI组平均瘤重明显小于对照组(P0.05),而Tet组及FSRI组平均瘤重则无明显差异性,但是均明显低于5-FU组(P0.05)。Tet+FSRI组平均瘤重最低(P0.05)。6 MDR1基因的mRNA在5组原位移植小鼠实验动物模型中的表达水平实验结果明确显示,在5组原位移植小鼠实验动物模型中MDR1mRNA的表达存在明显差异性。在Control组中MDR1 mRNA的相对表达水平为1.0404±0.0562；在5-FU组中相对表达水平为3.4404±0.6827；在Tet组表达水平为0.5414±0.0270；在FSRI组表达水平2.3210士0.1982；在Tet+FSRI组表达水平为1.8454±0.3006。5组实验动物的MDR1 mRNA表达水平比较差异有统计学意义(P0.05)。MDR1 mRNA的表达在5组由强到弱的顺序为5-FU组、FSRI组、Tet+FSRI组、Control组、Tet组。7 Survivin基因的mRNA在5组原位移植小鼠实验动物模型中的表达水平实验结果明确显示,在5组原位移植小鼠实验动物模型中Survivin mRNA的表达存在明显差异性。在Control组中Survivin mRNA的相对表达水平为1.0544±0.1442；在5-FU组中相对表达与水平为3.3746±0.4746；在Tet组表达水平为0.5360±0.0623；在FSRI组表达水平2.4096±0.1164；在Tet+FSRI组表达水平为1.868±0.3814。5组实验动物的Survivin mRNA表达水平比较差异有统计学意义(P0.05)。Survivin mRNA的表达在5组由强到弱的顺序为5-FU组、FSRI组、Tet+FSRI组、Control组、Tet组。8 P-gp蛋白在5组原位移植小鼠实验动物模型中的表达水平实验结果明确显示,在5组原位移植小鼠实验动物模型中P-gp蛋白的表达存在明显差异性。在Control组中P-gp蛋白的相对表达率为1.0404±0.0562；在5-FU组中阳性表达率为3.4404±0.6827；在Tet组阳性表达率为0.5414+0.0270；在FSRI组阳性表达率为2.3210±0.1982；在Tet+FSRI组阳性表达率为1.8454±0.3006。5组实验动物的P-gp蛋白的表达比较差异有统计学意义(P0.05)。P-gp蛋白的表达在5组由强到弱的顺序为5-FU组、FSRI组、Tet+FSRI组、Control组、Tet组。9 Survivin蛋白在5组原位移植小鼠实验动物模型中的表达水平实验结果明确显示,在5组原位移植小鼠实验动物模型中Survivin蛋白的表达存在明显差异性。在Control组中Survivin蛋白的阳性表达率为1.0544±0.1442；在5-FU组中阳性表达率为3.3746±0.4746；在Tet组阳性表达率为0.5360±0.0623；在FSRI组阳性表达率2.4096±0.1164；在Tet+FSRI组阳性表达率为1.868±0.3814。5组实验动物的Survivin蛋白的阳性表达比较差异有统计学意义(P0.05)。Survivin蛋白的表达在5组由强到弱的顺序依次为5-FU组、FSRI组、Tet+FSRI组、Control组、Tet组。结论：1汉防己碱联合植入用缓释氟尿嘧啶能够改善胃癌小鼠的一般状况(包括精神、食欲、体重、活动及机体反应等情况)。2汉防己碱联合植入用缓释氟尿嘧啶能够有效抑制肿瘤细胞的生长。3汉防己碱联合植入用缓释氟尿嘧啶能够明显降低肿瘤组织MDR1 /P-gp及Survivin mRNA的表达。4汉防己碱联合植入用缓释氟尿嘧啶能够明显降低肿瘤组织P-gp及Survivin蛋白的阳性表达,有效逆转MDR。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2

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