【摘要】：[目的]根据2014年《中国乳腺癌》报道,乳腺癌是中国女性肿瘤患者中发病率居首位,死亡率居第五位的恶性肿瘤。尽管目前一些乳腺癌患者得到了有效的治疗,但仍具有很高的复发率。极微量的乳腺癌干细胞是存在于乳腺癌组织中具有自我更新和分化潜能的细胞,是肿瘤形成的起始细胞,维持肿瘤生长、放化疗耐受和新生血管形成,是肿瘤发生发展以及复发的根源。乳腺癌起始细胞具有成瘤活性,并高表达CD44+/CD24-/low和其他干细胞标志物,如CD133、ALDH1和CD55等,表现出干细胞样特征。采取分选鉴定干细胞样乳腺癌细胞将能更清晰认识其特征,从而寻找更有效的方法治疗乳腺癌,防止其复发以提高临床治愈率。免疫治疗利用机体自身免疫系统靶向肿瘤,可以克服常规治疗方法的不足。目前一种新的免疫治疗策略是利用基于树突状细胞(Dendritic Cell, DC)疫苗启动T淋巴细胞,介导抗肿瘤免疫作用。但是,使用人乳腺癌干细胞作为抗原是否可以增强DC抗乳腺癌干细胞的免疫作用尚不清楚。本研究中我们分离并鉴定了来源于乳腺癌患者手术后肿瘤组织的干细胞样乳腺癌细胞,探索干细胞样乳腺癌细胞裂解物作为抗原,负载DC刺激诱导靶向人乳腺癌干细胞的细胞毒性T淋巴细胞的抑瘤活性,达到增强免疫功能和提高抗肿瘤免疫的目的。本项研究拟通过采集临床乳腺癌患者手术后肿瘤组织,分离培养获得干细胞样乳腺癌细胞(Breast cancer Stem-like Cell, BSC),经流式细胞仪鉴定其干细胞标志物,建立动物模型观察其体内成瘤性。将BSC制备成细胞裂解物负载DC后激活毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocytes, CTL),获得经负载BSC裂解物的DC激活的CTL (BSC-CTL)。体外杀伤实验分析BSC-CTL抗乳腺癌干细胞的活性,ELISPOT实验观察IFN-γ表达情况,动物体内实验研究BSC-CTL的抑瘤能力,为靶向BSC的治疗提供新的理论依据。[方法]经医学伦理委员会讨论并签署知情同意书,收集16位乳腺癌患者手术后肿瘤组织,临床诊断经组织学和病理学确认。机械法处理肿瘤组织,所得组织碎片用胶原酶和透明质酸酶消化过滤获得乳腺癌单细胞悬液,用含有bFGF、EGF、胰岛素和B27的无血清DMEM-F12(1:1)培养基培养,分散的乳腺癌细胞成乳腺球样生长。使用抗CD44-PE、抗CD24-FITC和抗CD133-PE进行染色,检测其干细胞标志物表达水平,以及在动物体内分析其成瘤性和转移能力。经Ficoll/Paque淋巴细胞分离液密度梯度离心获得正常人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC),诱导成未成熟DC并负载BSC获得成熟DC；成熟DC 3次刺激T淋巴细胞得到毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocytes. CTL),通过CytoTox 96非放射性细胞毒性试剂盒检测乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)释放,以及IFNγ ELISPOT检测IFNγ表达水平分析其对BSC杀伤活性。建立荷乳腺癌干细胞的动物模型,接种后第7、9、11天尾静脉注射1×105/g剂量的成熟DC激活的CTL,研究DC靶向乳腺癌干细胞的抗肿瘤的免疫功能。[结果](1)乳腺癌单细胞经48小时无血清培养后,一部分乳腺癌单细胞悬浮生长,逐渐形成微小乳腺球,继续培养能够形成较大的乳腺球；一部分贴壁生长；一部分在培养过程中发生凋亡或保持不分化。采用流式细胞仪检测干细胞标志物CD44和CD24表达水平；其中来自6例乳腺癌患者(占总数的37.5%)肿瘤组织的成乳腺球状悬浮生长的肿瘤细胞表达高比例的CD44+/CD24-/low;该6位患者中,4位免疫组化HER-2(-)、ER(-)和PR(-),1位HER-2 (+/++)、ER(-)和PR(-),另外一位HER-2(+)、ER(+)和PR(-)。来自于患者7和患者11的乳腺球细胞表达CD44+/CD24-/low的比例分别为97.69%和99.45%。(2)与在乳腺癌单细胞培养过程中贴壁生长的肿瘤细胞相比较,成乳腺球状悬浮生长的细胞具有更明显的干细胞特征。流式细胞仪检测成乳腺球细胞和乳腺癌贴壁细胞中CD44+/CD24-/low比例分别为91.8%和0.08%,然而在贴壁细胞中CD44+/CD24+双阳性比例大大高于成乳腺球细胞,分别为61.59%和0.77%；干细胞标志物CD133在成乳腺球状悬浮生长的细胞中高表达,患者9的成乳腺球细胞和贴壁细胞中表达CD133比例分别为96.67%和43.78%。经免疫荧光检测雌性激素受体(Estrogen Receptor, ER)、孕酮激素受体(Progesterone Receptor, PR)和人表皮生长因子受体(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER-2, or ErbB-2),观察到贴壁细胞表达ER、PR和HER-2抗原,但成乳腺球细胞却不表达。(3)接种了1×104个成乳腺球状悬浮生长的乳腺癌细胞的裸鼠在5天内就形成了肿瘤,而接种了1×106个贴壁细胞生长的乳腺癌细胞的裸鼠在7天后才形成肿瘤；成乳腺球细胞接种的全部小鼠在第10天时均出现了肝和肺转移,然而,移植了1×106贴壁细胞的实验组中观察到仅有一只小鼠出现肺转移；因此,乳腺癌患者肿瘤组织来源的成乳腺球状悬浮生长的肿瘤细胞具有乳腺癌干细胞特征。鉴于此,为了表述方便起见,在本研究中亦称这群乳腺癌患者肿瘤组织来源的成乳腺球状悬浮生长的肿瘤细胞为干细胞样乳腺癌细胞(Breast cancer stem-like cell, BSC)。(4)分别负载了乳腺球细胞裂解物、贴壁细胞裂解物以及无抗原诱导成熟的DC,分别激活T淋巴细胞产生CTL活性,各组间杀伤乳腺癌细胞的细胞毒性均随着效靶比升高而不断提高。1)负载了成乳腺球样悬浮生长的干细胞样乳腺癌细胞裂解物的DC刺激T淋巴细胞得到的细胞毒性T淋巴细胞(BSC-CTL)对乳腺球细胞杀伤活性明显高于贴壁生长的乳腺癌细胞裂解物负载DC刺激T淋巴细胞得到的细胞毒性T淋巴细胞(BAC-CTL)对乳腺球细胞的杀伤活性(P0.01)；2) BSC-CTL对乳腺球细胞杀伤活性明显高于对照组(Blank-CTL),(P0.01)；3) BAC-CTL对乳腺球细胞的杀伤活性与对照组近似；4) BAC-CTL对贴壁细胞的杀伤活性大于BSC-CTL对贴壁细胞的杀伤活性(P0.05)5) BAC-CTL;对贴壁细胞的杀伤活性高于Blank-CTL对贴壁细胞的杀伤活性(P0.05)；6) BSC-CTL对贴壁细胞的杀伤活性与对照组近似；7) BAC-CTL对贴壁细胞的杀伤活性明显高于对乳腺球细胞的杀伤活性(P0.01)；8) BSC-CTL对乳腺球细胞的杀伤活性高于对贴壁细胞的杀伤活性(P0.05)。(5)乳腺癌细胞抗原刺激DC诱导重要的T细胞应答, BSC-CTL和BAC-CTL对乳腺球细胞效靶比为10：1杀伤应答中产生IFNγ分泌斑点数分别为52个和31个；通过斑点计数和计算覆盖面积,BSC-CTL产生的IFNγ明显高于BAC-CTL(P0.05),并且BSC-CTL和BAC-CTL产生的IFN-y明显高于Blank-CTL(P0.01和P0.05),另外,效靶比的提高也显著增加了IFNγ产生的斑点数和覆盖面积。(6)5周龄NOD/SCID小鼠右前肢腋腔皮下乳腺脂肪垫接种BSC。Blank-CTL免疫治疗的全部荷瘤小鼠平均存活31.4天。使用BAC-CTL免疫治疗的小鼠存活时间平均值为35天,而使用BSC-CTL免疫治疗的小鼠平均存活期为56.1天,监控时间增加到70天时,还有40%小鼠存活着；Kaplan-Meier生存期曲线分析显示BSC-CTL免疫治疗的小鼠生存期小组显著地高于其它实验组(P0.001)。[结论]本项研究中我们证实了BSC高表达干细胞相关分子,即CD44+/CD24-/low和CD133+,而BAC高表达CD44+/CD24+,同时低表达CD133+。BSC体内成瘤能力强于BAC。应用BSC裂解物负载的DC疫苗引发了特异的抗乳腺癌干细胞T淋巴细胞应答。DC疫苗激活了Thl应答和诱导了关键的IFN-y产生,与激活的CTL数量成正相关。在建立的乳腺癌干细胞动物模型中,揭示了使用BSC-CTL具有显著的抗BSC的免疫作用,而BAC-CTL没有显著的抗BSC免疫作用。BSC-CTL明显地延长了荷乳腺癌干细胞动物的存活时间。本研究结果证明了富含CD44+/CD24-/low/CD133+乳腺球的乳腺癌细胞具有肿瘤干细胞(BSC)特征,应用其抗原负载的DC疫苗产生了强大的抗肿瘤免疫,将可能提高乳腺癌干细胞特异性免疫治疗的靶向性和加速肿瘤疫苗的发展。[目的]本研究的目的是探讨CYP2C9*3多态性对格列齐特在Ⅱ型糖尿病患者的治疗反应的影响。[方法]本研究共纳入746例Ⅱ型糖尿病患者。入选后,患者继续4周格列齐特治疗,治疗前后测定空腹血糖。低血糖事件发生和生活方式的信息收集每周跟进。rs1057910基因分型采用单碱基引物延伸法进行。t检验、方差分析和卡方检验被用来评估rs1057910等位基因对格列齐特治疗反应的影响。[结果]治疗后,空腹血糖明显下降,从11.2-2.7毫摩尔/升到8-2.2毫摩尔/升(P0.001)。rs1057910位点的AC/CC基因型患者相比于AA型空腹血浆葡萄糖降低程度更大(3.6 vs 3 mmol/L,P0001:31.4 vs 24.5%,P0.001),治疗成功率更高(54.7 vs 37.5%,P0.001；51.4 vs 32.3%,P0.001；71.6 vs 48.3%,P0.001分别为1,2和3采用三种不同的判定标准)。[讨论]目前的研究表明在Ⅱ型糖尿病病人中rs1057910位点多态性显著影响格列齐特的治疗效果。风险等位基因与空腹血糖显著降低和格列齐特单一药物疗法具有较高治疗成功率相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
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本文编号：
2322995
