miR-214下调CrkL抑制食管鳞癌上皮-间质转化的机制研究

发布时间：2018-11-21 14:30

【摘要】：目的:中国食管癌的发生率约为13/10万,其中80%以上是鳞癌患者。虽然针对食管癌发病机理和诊断治疗开展了大量的科学研究,在早期诊断和治疗模式方面也取得了重要的突破和进展,但是食管癌患者的5年生存率仍低于20%。其中上皮间质转化(EMT)被认为是引起肿瘤发生侵袭和远处转移的重要因素,肿瘤细胞通过启动EMT,从原发肿瘤中分离出来,经血流迁移至其他部位,然后发生间质上皮转化(MET)进行定植和生长,达到远处转移的目的。microRNA是一段长约20个碱基的单链非编码RNA,可以与其靶基因3’非翻译区结合,在转录后水平抑制靶基因的表达,或者直接降解靶基因的mRNA。在食管鳞癌中,我们首次发现miR-214在癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织,同时发现miR-214的表达与淋巴结的转移呈负相关,提示miR-214可能参与调控食管鳞癌的侵袭和转移。CrkL(CT10激酶调节子样蛋白)是Crk信号接头蛋白家族中的一员,参与多个信号通路的传导,从而调节细胞内外蛋白之间的各种反应。诸多研究证实CrkL在细胞的增殖、粘附、转移、对病原体的应答以及凋亡过程中均发挥作用,现已发现在卵巢癌、胃癌、慢性粒细胞白血病和非小细胞肺癌中CrkL的表达均有上升。在我们的前期工作中,通过基因表达谱芯片结合生物信息学分析筛选可能与调控食管鳞癌细胞EMT相关的miR-214靶基因。结果发现,CT10激酶调节子样蛋白的3’-非翻译区(3’-UTR)含miR-214潜在识别位点。基于此,本研究拟探索miR-214-CrkL通路对于食管鳞癌细胞发生EMT的影响方法:本研究分为以下三个部分:1、通过qPCR检测miR-214及CrkL在食管鳞癌及对应癌旁组织中mRNA水平上的表达。通过Western blot及免疫组化分别检测CrkL在食管鳞癌及对应癌旁组织中蛋白水平上的表达。统计分析miR-214及CrkL表达与食管鳞癌病人肿瘤的浸润程度和淋巴结转移的相关性。2、通过miR-214模拟物/抑制物及相应的阴性对照转染人食管鳞癌细胞株Eca-109,确定转染效率后检测各组细胞中CrkL及EMT标记物E钙粘蛋白(Ecadherin)和N钙粘蛋白(N-cadherin)在mRNA及蛋白层面表达水平的变化,并且通过Transwell和Wound-Healing实验检测转染后细胞侵袭和迁移能力的变化。3、通过miR-214模拟物/pcDNA.CrkL共转染食管鳞癌细胞株,同时转染miR-214模拟物/pcDNA.Null作为对照,考察高表达Crk L能否消除miR-214对EMT的抑制作用,通过双荧光素酶报告基因实验考察miR-214对CrkL的靶向抑制作用。结果:1、PCR结果表明食管鳞癌组织中的miR-214的表达相对于对照组明显降低(P0.05),而PCR及Western Blot的结果证实肿瘤组织中CrkL在mRNA及蛋白层面的表达相对于对照组均明显升高(P0.05)。miR-214的低表达和CrkL的高表达则提示肿瘤浸润深度更深(P=0.04,P=0.013)并且更加容易发生淋巴结转移(P=0.033,P=0.012)。2、在细胞层面上,通过miR-214模拟物/抑制物及相应阴性对照分别转染食管鳞癌细胞株,发现转染miR-214模拟物组中Crk L和N-cadherin在翻译前后水平的表达均低于对照组(P0.05),而E-cadherin的表达却明显高于对照组(P0.05)。转染miR-214抑制物组中CrkL和N-cadherin的表达均高于对照组(P0.05),而E-cadherin的表达显著低于对照组(P0.05)。同时Transwell和Wound-Healing实验证实转染miR-214模拟物的细胞的侵袭和迁移能力明显低于对照组(P0.05),而转染miR-214抑制物的细胞的侵袭和迁移能力明显低于对照组(P0.05)。3、Eca-109细胞共转染miR-214模拟物/pcDNA.Crk L后,同时转染miR-214/pcDNA.Null为对照,经PCR和Western Blot实验检测,实验组中Ecadherin的表达明显低于对照组(P0.05),N-cadherin打的表达高于对照组(P0.05)。Transwell和Wound-Healing结果示相比于对照组,实验组穿透基膜的细胞数明显减少,迁移的速度明显下降。荧光素酶基因报告试验证实在Crk L的3’非翻译区存在miR-214的结合位点,表明miR-214对Crk L表达的靶向抑制作用。结论:miR-214在食管鳞状细胞癌组织中低表达,而其潜在的下游调控蛋白Crk L却高表达,并且低表达的miR-214和高表达的CrkL预示着肿瘤浸润深度的加深和更多的阳性淋巴结个数。过表达miR-214后,CrkL和N-cadherin的表达下降,E-cadherin表达上升,且细胞的迁移及侵袭能力均有显著下降。同时过表达miR-214和Crk L后发现高表达CrkL可以抵消miR-214对EMT的抑制作用,荧光素酶基因报告试验也证实miR-214对CrkL表达的靶向抑制作用。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.1

【参考文献】

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1 ;Identification of deregulated miRNAs and their targets in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2012年38期

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本文编号：2347245