精氨酸琥珀酸合成酶（ASS1）对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

发布时间：2018-11-26 07:42

【摘要】：研究背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinama,HCC)是全球范围内对人们的健康威胁最大的恶性肿瘤之一,严重危害着人们的健康[1]。每年原发性肝癌的发病率在恶性肿瘤发病率中排第5位,男性病死率更是居于第2位[2]。在世界范围内,每年的增加的肝癌患者中,男性患者为530,000例,女性患者为230,000例,分别在癌症位增加率的第4位和第8位,而每年由于肝癌而死亡的人群中男性为460,000例,女性为211,600例[3]。过去10年中,我国的原发性肝癌的发病率持续升高,且速度惊人。随着社会的快速发展,人口结构和生活方式发生了巨大的改变,在城市,尤其是大中型城市,原发性肝癌已经位列恶性肿瘤死亡率第2位。尽管随着医疗技术的发展以及人们对HCC认识的不断深入,如肝移植,手术切除等等,但原发性肝癌患者的3年生存率仍未明显提高。就目前来说,如何早期诊断以及控制术后复发的仍是HCC研究的重中之重。现以证实肝癌是由于一系列分子和信号通路紊乱而造成的。因此,找到有效的作用靶点和探索肝癌的发生机制已成为治疗原发性肝癌的重点和难点。肝脏在代谢、解毒和排泄等方面发挥重要作用,当发生肝癌,肝硬化时,机体内正常的生理反应会受到影响。血氨在临床工作中具有重要意义,可用于肝性脑病的诊断和鉴别,正常人血氨为18~72μmol/L。正常人体内的氨主要在肝脏中合成尿素,然后经肾脏排除体外[4]。在脑、心肌和骨骼肌等组织中,谷氨与谷氨酸在氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)的作用下,生成谷氨酰胺,后经循环系统将谷氨酰胺转运至肝脏中,谷氨酰胺在谷氨酰胺酶(glutaminase)的作用下重新生成氨,最后合成尿素[5]。尿素循环(urea cycle)是哺乳动物代谢氨一个途径。首先,在肝细胞的胞浆中,氨基酸与α-酮戊二酸通过转氨基作用生成谷氨酸,并进入线粒体基质,经谷氨酸脱氢酶催化后生成的一分子的氨[6];然后,氨基甲酰合成酶I催化游离的氨与CO2、2分子ATP,生成氨基甲酰磷酸,氨基甲酰磷酸在鸟氨酸转氨基转移的催化下生成瓜氨酸[7];随后,瓜氨酸进入肝细胞胞浆,在精氨酸代琥珀酸合成酶的催化下,与天冬氨酸缩合成,并消耗一分子ATP,天冬氨酸在反应中充当氨基供体[8];最后,精氨酸代琥珀酸裂解生成精氨酸和延胡索酸,而精氨酸被精氨酸酶的催化水解,生成尿素与鸟氨酸[9]。精氨基琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthetase,ASS),是一种催化瓜氨酸及天冬氨酸催生成精氨基琥珀酸的酶,反应需要ATP供能,它是尿素循环中重要的限速酶[10]。目的本研究拟采用慢病毒转染技术将shRNA-ASS1转入SMMC-7721细胞中,沉默ASS1基因,观察ASS1基因沉默后SMMC-7721细胞的增殖与凋亡情况及其可能的作用机制。材料与方法1.采用Real-time PCR和Western Blot法检测ASS1mRNA和蛋白在Changliver、SMMC-7721、HepG2、HepG3B和QGY-7703细胞中表达差异。2.运用慢病毒转染技术将shRNA-ASS1转入SMMC-7721细胞中,Real-time PCR和Western Blot法检测ASS1mRNA和蛋白的表达情况。3.CCK-8法检测shRNA-ASS1对SMMC-7721细胞增殖的影响情况4.流式细胞术检测shRNA-ASS1对SMMC-7721细胞凋亡的影响情况5.Western Blot法检测shRNA-ASS1对Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡蛋白表达的影响。6.采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差(X±S)表示,两组数据间的比较采用student’s-t检验,多组数据间的比较用单因素方差分析,P0.05认为差异有统计学意义。结果1.与Changliver细胞、HepG2细胞和QGY-7703细胞相比ASS1 mRNA和蛋白在SMMC-7721细胞和HepG3B细胞中呈高表达。ASS1 mRNA在SMMC-7721细胞和HepG3B细胞中的相对表达量明显高于其他细胞,差异有统计学意义(P0.05);ASS1蛋白在SMMC-7721细胞和HepG3B细胞中表达量高于其他细胞,差异有统计学意义(P0.05)。2.shRNA-ASS1转染组SMMC-7721细胞较空白对照组SMMC-7721细胞相比,ASS1蛋白水平明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。阴性对照组SMMC-7721细胞空白对照组细胞相比,ASS1蛋白水平无明显变化,差异无统计学意义(P0.05)。这表明shRNA-ASS1明显移至SMMC-7721中ASS1基因的表达。3.CCK-8结果显示,与空白对照组和阴性对照组相比,shRNA-ASS1细胞生长受到明显抑制,并与Mock组相比差异均有统计学意义(P0.05),Mock组和NC组细胞生长无明显差别(P0.05)。4.流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,空白对照、阴性对照组及shRNA-ASS1组凋亡率分别为(0.3±0.12)%,(3.0±1.08)%和(27.1±3.52)%;与空白对照组相比,shRNA-ASS1组细胞凋亡率明显上升并且差异具有统计学意义(P0.05),空白对照组和阴性对照组细胞生长无明显差别(P0.05)。5.转染shRNA-ASS1 72h后,ASS-1 shRNA较空白对照组组相比Bax、Cleaved Caspase-3的表达较对照组上调(P0.05),bcl-2、的表达较对照组下调(P0.05),空白对照组和阴性对照组细胞生长无明显差别(P0.05)。结论1.靶向ASS1基因的RNA干扰能够抑制SMMC 7721细胞增殖,诱导细胞凋亡,且这种凋亡依赖于caspase家族的激活。2.ASS1基因具有作为治疗原发性肝癌靶点的潜在价值。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【参考文献】