【摘要】：【目的】探讨TGF-β1调控的mi RNA在三阴性乳腺癌(TNBC)恶性演进中的生物学功能和分子机制,为TNBC的临床诊断、治疗和预后评估提供新的生物标志物和新的分子治疗靶点。【方法】第一部分:1、应用实时荧光定量PCR检测MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中microRNA基因芯片筛选的五种TGF-β1调控的miRNA表达量。2、利用外源性TGF-β1细胞因子刺激五种不同侵袭性的乳腺癌细胞株,检测miR-196a-3p的表达水平与各细胞株侵袭性的相关性。3、应用Transwell实验检测过表达miR-196a-3p的MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的改变。4、应用MTT实验检测过表达miR-196a-3p的MDA-MB-231细胞增殖水平的改变。第二部分:1、应用实时荧光定量PCR筛选出外源性TGF-β1细胞因子刺激下表达水平升高的miR-196a-3p候选靶基因。2、应用实时荧光定量PCR和Western Blot法检测转染miR-196a-3p模拟物后,MDA-MB-231细胞中候选靶基因ZNF280B与NRP2 mRNA和蛋白水平的表达改变。3、应用实时荧光定量PCR检测转染不同浓度梯度的miR-196a-3p模拟物后,MDA-MB-231细胞中候选靶基因NRP2的表达水平变化。4、应用荧光素酶双报告基因系统验证miR-196a-3p对NRP2的3’-UTR是否具有抑制调控作用。第三部分:1、应用实时荧光定量PCR检测NRP2 siRNA对MDA-MB-231细胞中NRP2表达水平的抑制效率。2、应用Transwell实验检测低表达NRP2的MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的改变。3、应用MTT实验检测低表达NRP2的MDA-MB-231细胞增殖水平的改变。第四部分:1、构建裸鼠移植瘤模型,检测miR-196a-3p对TNBC移植瘤生长的影响。2、构建TNBC肺转移模型,检测miR-196a-3p对TNBC肺转移的影响。3、应用实时荧光定量PCR检测乳腺癌组织与正常乳腺组织中mi R-196a-3p表达水平的差异。4、应用实时荧光定量PCR检测不同分子亚型的乳腺癌中miR-196a-3p表达水平的差异。【结果】第一部分:1、miR-196a-3p在MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞之间差异性表达最明显。2、随着乳腺癌细胞株侵袭性逐渐增强,miR-196a-3p的表达水平逐渐下降。在侵袭性最强的MDA-MB-231细胞中,其表达水平最低。3、高表达的miR-196a-3p能够抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力。4、高表达的miR-196a-3p对MDA-MB-231细胞的增殖能力没有影响。第二部分:1、在外源性TGF-β1细胞因子刺激下,MDA-MB-231细胞中ZNF280B和NRP2的表达水平升高。2、在MDA-MB-231细胞中,只有NRP2 mRNA和蛋白表达水平与高表达的miR-196a-3p呈负相关。3、随着MDA-MB-231细胞中miR-196a-3p模拟物转染浓度的升高,候选靶基因NRP2的表达水平逐渐下降。4、miR-196a-3p能够与靶基因NRP2的3’-UTR特异性位点互补配对结合,从而发挥对NRP2的抑制调控作用。第三部分:1、NRP2 siRNA显著抑制MDA-MB-231细胞中NRP2的表达水平。2、NRP2 siRNA能够抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力。3、NRP2siRNA对MDA-MB-231细胞的增殖能力没有影响。第四部分:1、miR-196a-3p对TNBC移植瘤的生长没有影响。2、miR-196a-3p显著抑制TNBC肺转移进程。3、乳腺癌组织中miR-196a-3p呈低表达状态。4、miR-196a-3p在基底样型乳腺癌中表达最低。【结论】在TNBC发展过程中,肿瘤微环境的TGF-β1浓度升高,抑制了下游miR-196a-3p的表达,促使miRNA对癌基因NRP2的调控抑制作用消失,靶基因NRP2表达水平得以上升,肿瘤细胞获得更强的侵袭和转移能力,从而加速了TNBC的肺转移进程。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
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本文编号：2362897
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