钾离子通道KCa3.1在肝细胞肝癌中的表达及作用机制研究

发布时间：2018-12-08 20:04

【摘要】：背景:我国是原发性肝细胞肝癌的高发国家,占每年全球新发肝癌例数的55%左右,死亡人数占全球的40%以上,而且肝癌的发生率在世界范围内呈现增加趋势。尽管以手术切除为核心的肝癌综合治疗体系已经形成,但是术后肿瘤高复发率仍是威胁患者长期生存的主要因素。此外,对于无法实施手术的肿瘤晚期患者,目前也缺乏理想的治疗方案。近年来,随着对肿瘤发生发展相关机制的深入研究,以此为基础开发的分子靶向药物在临床逐渐得到推广,这给晚期肝癌患者带来希望的同时也存在药物疗效欠佳、副作用较大等方面的问题。因此,探索肝细胞肝癌新的发病机制、寻找新的潜在治疗靶点具有极其重要的临床和科学意义。目的:本项目前期通过基因芯片技术筛选出在肝细胞癌组织和正常肝组织中差异表达的钾通道,并通过PCR和Western Blot进行验证。系统研究筛选出的钾通道KCa3.1在人肝细胞癌中的表达模式及功能,明确钾通道KCa3.1的表达与肝细胞癌临床病理特征和患者预后的关系,通过进一步的体内和体外研究阐明钾通道KCa3.1在肝细胞癌发生、发展中的作用及其细胞分子机制,为肝细胞癌的治疗提供新的理论依据和防治策略。方法:1.收集95对肝癌临床标本,PCR、Western Blot、免疫组化技术研究KCa3.1的表达及定位,并分析其表达与临床病理特征、患者预后的关系。2.利用慢病毒转染建立稳定高/低表达钾离子通道KCa3.1的人肝癌细胞株(Huh7、LM3细胞),观察KCa3.1的表达情况对肝癌细胞细胞功能学的影响。在两个肝癌细胞株中分别沉默或过表达KCa3.1,利用Cell Counting Kit-8(CCK8)、EdU实验检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞的周期和凋亡水平;集落形成实验检测细胞的集落形成能力;Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力。3.将稳定高/低表达钾离子通道KCa3.1的人肝癌细胞株(Huh7、LM3)接种至裸鼠皮下,通过构建人肝癌裸鼠皮下移植模型,比较KCa3.1的表达情况对裸鼠皮下移植瘤成瘤能力的影响。4.将沉默KCa3.1的Huh7细胞以及作为阴性对照Huh7细胞进行人基因表达谱芯片检测,将差异表达基因进行聚类、通路分析、IPA分析;选取芯片结果中升高降低较明显的基因,设计引物,在Huh7细胞和LM3细胞中(沉默或过表达KCa3.1)进行验证。5.根据细胞功能学结果及芯片分析结果,Western Blot检测周期相关通路以及EMT相关通路。6.根据芯片分析结果以及Western Blot结果,发现SKP2以及RELN可能是KCa3.1功能发挥相关的靶基因,利用SKP2表达质粒及RELN小干扰RNA进行补救实验。结果:1.与癌旁组织相比,PCR结果显示肝癌组织与癌旁组织之间KCa3.1 mRNA的表达差异不大;Western Blot结果显示KCa3.1在低分化肝癌组织中表达升高;免疫组化实验结果提示KCa3.1蛋白主要表达在胞膜胞浆中,KCa3.1的表达情况与癌组织的组织学分级相关。2.肝癌细胞Huh7、LM3沉默KCa3.1之后,细胞的增殖能力减弱,迁移和侵袭能力减弱,凋亡细胞增多,细胞周期阻滞,过表达KCa3.1之后,细胞的增殖能力增强,迁移侵袭能力增强,凋亡细胞减少,细胞周期进展。3.肝癌裸鼠皮下移植瘤实验提示Huh7、LM3细胞沉默KCa3.1之后,裸鼠皮下成瘤能力减弱,过表达KCa3.1之后,裸鼠皮下成瘤能力增强。4.基因芯片结果提示细胞周期相关信号通路的激活受到KCa3.1表达情况的影响,此外,KCa3.1沉默或过表达后,SKP2、RELN基因的表达发生明显变化。5.Western Blot结果发现钾离子通道KCa3.1可以激活细胞周期相关的通路以及EMT相关通路。6.SKP2的补救实验证实KCa3.1可以通过调控SKP2/p21、p27信号通路控制肝癌细胞周期进展,影响肝癌细胞的增殖能力,RELN的补救实验证实KCa3.1可以通过RELN调控肝癌细胞的迁移侵袭。结论:钾通道KCa3.1在低分化肝癌组织中表达明显升高;肝癌细胞沉默KCa3.1后可以减弱肝癌Huh7和LM3细胞的增殖能力、迁移、侵袭能力以及裸鼠皮下成瘤能力,阻滞细胞周期以及增加细胞凋亡水平,过表达KCa3.1可以逆转上述效应;KCa3.1可以通过调控SKP2/p21、p27信号通路控制肝癌细胞周期进展,影响肝癌细胞的增殖能力;KCa3.1可以调控RELN以及EMT信号通路控制肝癌细胞的迁移侵袭能力。以上研究表明KCa3.1在肝细胞肝癌的发生发展中发挥重要作用,是肝癌治疗的潜在靶点,对KCa3.1相关的上下游基因、信号通路的研究可以为肝癌治疗提供更多可供选择的靶点。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【参考文献】