肿瘤抑制性miRNA-193b通过DNAJC13和RAB22A靶点促进乳腺癌发展

发布时间：2018-12-10 15:06

【摘要】：乳腺癌是导致患癌妇女死亡的主要原因。尽管局部控制的治疗方法有了改善，转移复发仍然难以治愈，更好的了解促进疾病进展的生物学基础是非常重要的。乳腺癌是导致全世界患癌妇女死亡的第二病因，2012年共诊断1700万新病例，且有522000人死亡。自2008年起，乳腺癌的发病率增至20%以上，死亡率增至14%［1］。随着乳腺癌筛查和治疗的发展，大约80%病灶局限的患者可获得生存期延长。然而，没有证据表明转移复发的早期发现能使生存获益，转移复发的发展仍然难以控制［2］，重视并深入理解引起疾病进展的机制非常重要，并为开展新的治疗策略提供理论依据。微小RNA（miRNAs）是一类内源性非编码RNAs，在基因的负调节中通过对mRNAs靶点的翻译抑制或降低起重要作用［3］。miRNA具有调节一系列生物进程的特征，包括发育，分化，凋亡和癌症发生发展［4］。miRNAs可作为癌基因或肿瘤抑制物发挥作用，并且有独特的能力调节许多蛋白编码基因［5］。单个miRNA可潜在的调节几百个或上千个基因［6］。近几年，miRNAs在人类癌症中的作用被广泛研究，并发现许多人类癌症中miRNAs的表达异常。大量的证据表明某些微小RNAs可能在高危病人中起选择性工具的作用，或者miRNAs自身可被视为治疗的靶点［4］。现已充分表明，乳腺癌中miRNAs的异常调节。miR-10b是第一个被描述的乳腺癌相关微小RNA，它在转移乳腺癌细胞中高表达，并且正调节乳腺癌的转移和侵袭［7］。miR-155和miR-21被证实是通过调节关键耐药相关蛋白诱导化疗药耐药［8］。miR221/222被证实在体外通过针对细胞周期抑制物p27-Kip1和Era实现抗内分泌耐药的关键调节［9］。miR-193b的调节异常在淋巴瘤［10］，头颈部鳞癌［11］，非小细胞肺癌［12］和前列腺癌［13］中有过报道。然而，目前仍不了解miR193-b和他们的靶点之间的是如何相互作用导致疾病发生发展的。因此，我们报道了miR-193b在原发人乳腺癌细胞系中的向下调节作用，并且确认了DNAJC13（HPS40）和RAB22A是miR193b潜在的作用的靶点，通过调节RAS癌基因通路，强调了miR-193b在乳腺癌进展中的生物重要性。目的：检测miR-193b在人类正常乳腺上皮细胞和肿瘤细胞中的表达水平，探讨miR-193b的表达在肿瘤细胞增殖、克隆形成、迁移浸润、肿瘤形成中的作用。并通过使用计算机预测算法用来对miR-193b的作用靶点进行确认。方法： miRNA的实时定量PCR和mRNAs的表达：利用real-timeRT-PCR技术，对人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞系MCF-10A检测miR-193b的表达水平。将化学合成的阴性干扰对照（negative-scramble control，SC）和pre-miR-193b mimic分子分别瞬时转染乳腺癌细胞，利用real-timeRT-PCR技术检测空白转染组、阴性干扰转染组、pre-miR-193bmimic转染组各组细胞中miR-193b的表达，以证实转染效果。使用Transwell迁移实验、侵袭实验，检测negative-scramblecontrol、pre-miR-193b mimic瞬时转染对乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响。细胞增殖和克隆形成实验：MTT用于评估细胞增殖和pre-miR-193b mimic转染MDA-MB-231细胞后的细胞毒性。细胞用SC对照、pre-miR-193b，Lipofectamine2000逆转录，并接种于96孔板（5×103/孔）。转染24、48、72小时后测定细胞存活率。克隆形成实验用于评价pre-miR-193b对MDA-MB-231细胞的作用。转染后的细胞接种于12孔板。48小时后，收集细胞并按500/ml重新接种于6孔板（重复3次）。孵育14天后，固定并染色培养板，进行克隆计数。存活细胞数与SC转染的细胞进行比较。采用三维细胞培养技术，将pre-miR-193b mimic、negative-scramble control转染MCF-7细胞后，观察乳腺癌细胞形成腺泡样结构的能力是否受到影响。MCF-7细胞接种于8孔细胞培养切片（champered slide）中，在含有人工基质胶（Matrigel）的培养环境中孵育14天后，观察乳腺癌细胞形成腺泡样结构的数量和直径变化。用6种miRNA靶点预测软件：miRanda, mi-RDB, miRWalk,PICTAR5, RNA-22和TargetScan来预测miR-193b潜在的靶点。荧光素酶报告：因为下游靶基因与miR-193b的结合位点是它们的3'-UTR区，用PCR扩增了DNAJC13（HPS40）和RAB22A基因的一个区域，并在pMIRREPORT荧光素酶载体中萤火虫荧光素酶基因的下游构建靶基因。一个变异序列克隆后作为验证质粒。pMirluciferase或pMir-luciferase_gene特异载体与pre-miR-193b或SC共同转染至MDA-MB-231细胞系中。含有海肾荧光素酶的pRL-SV载体作为对照进行转染。转染48小时后，用双荧光素酶报告实验对萤火虫和海肾荧光素酶的活性进行检测。建立小鼠乳腺癌细胞接种模型， pre-miR-193b mimic和negative-scramble control转染乳腺癌细胞，接种于4~5周龄雌性NOD/SCID小鼠皮下脂肪垫内。记录小鼠体重变化情况，测量肿瘤体积变化，1个月后处死小鼠，测量肿瘤重量，观察有无肿瘤转移情况。结果： 1.乳腺癌细胞系中miR-193b的表达水平用人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231与正常乳腺上皮细胞系MCF-10A检测miR-193b的表达。与正常乳腺上皮细胞系MCF-10A相比较，miR-193b的表达水平在这两个乳腺癌细胞系中显著地减少， MCF-7细胞系中减少70%，MDA-MB-231细胞系中减少82%，这与已发表的microRNA的蛋白质微阵列的研究结果一致。 2.miR-193b的过表达显著地减弱细胞增殖能力和小鼠成瘤能力乳腺癌细胞用40nmol/L的SC或pre-miR-193b mimic转染。转染48小时后，与SC转染组比较，可观察到miR-193bmimic转染后，miR-193b表达水平的持续升高，MCF-7细胞系中表达水平升高超过30倍，MDA-MB-231细胞系中升高18倍。miR-193bmimic转染MDA-MB-231细胞后，导致了细胞活力的下降，转染后48、72小时与对照比较分别为65%和50%。miR-193b过表达同样导致了MDA-MB-231细胞克隆形成能力的显著降低，存活分数与SC比较为22%比45%。Pre-miR-193b mimic和SC分别转染MCF-7细胞后，在三维培养条件下培养14天后各组细胞均可形成腺泡样结构，与SC组相比，pre-miR-139bmimic转染MCF-7细胞后所形成的腺泡样结构直径（减小47.6%）、数量（减少34.2%），均明显小于SC组（p＜0.05）。观察pre-miR-193b mimic转染组，SC转染组和空白组中小鼠接种MDA-MB-231细胞后的肿瘤形成情况。与SC组相比，肿瘤体积（减少37.8%）和重量（减少30.1%）明显减少（p＜0.05）。 3.miR-193b调节细胞迁移和浸润为了解miR-193b是否与细胞迁移或浸润的调节有关，使用体外穿孔（transwell）迁移和浸润实验。与它们相应的阴性对照比较，转染pre-miR-193b mimic显著地减弱了MDA-MB-231细胞的迁移能力。此外，转染pre-miR-193bmimic同样显著地减弱了MDA-MB-231细胞的浸润能力。 4.miR-193b潜在mRNA靶点的确定我们使用6种miRNA靶点预测软件：miRanda，mi-RDB，miRWalk，PICTAR5， RNA-22和TargetScan来预测miR-193b潜在的靶点。3个最可能的mRNAs被选出作进一步确认：DNAJC13(Hsp40或RME-8)是一个DNA域结合蛋白，是Hsp70的关键调节点；ERBB4（ViralOncogene Homolog-Like4）与细胞有丝分裂及分化有关系；RAB22A（RAS癌基因家族成员）参与细胞内吞作用和细胞内蛋白质运输。首先，我们用qRT-PCR评估了正常乳腺上皮细胞MCF-10A和两个乳腺癌细胞系（MCF-7、MDA-MB-231）中DNAJC13, ERBB4和RAB22A的基线水平。与正常对照相比，DNAJC13和RAB22A的表达水平在MDA-MB-231和MCF-7细胞中都显著地增加。ERBB4与正常对照相比，仅在MDA-MB-231细胞中的表达增加，而在MCF-7细胞中则表现为降低。当把pre-miR-193b mimic（40nM）转染入这些细胞系后，与正常对照比较，DNAJC13和RAB22A在两个细胞系中的表达均减少。下一步，，为了确定miR-193b对DNAJC13和RAB22A的调节是否通过结合它们的3'-UTR，我们利用pMIR-Report载体，在其萤火虫荧光素酶基因的下游构建了几个携带有预测结合位点的报道载体。对于荧光素酶检测，MDA-MB-231细胞同时转染pre-miR-193b（或negative-scramble control）和pmiR-DNAJC133’-UTR （或突变的pmiR-DNAJC133’-UTR）。含有DNAJC133’-UTR的报道载体被pre-miR-193b显著地抑制，而突变的报道载体不受影响。当我们使用pmiR-RAB22A3’-UTR (或突变的pmiR-RAB22A)在这个细胞系中得出了相同的结果。结论： miR-193b是一个新的乳腺癌肿瘤抑制性miRNA。 mir-193b至少通过对转录因子DNAJC13的调节，以及对癌基因RAB22A的调控发挥作用。 miR-193b下调的结果包括在体外促进细胞增殖、克隆形成、迁移和浸润；在体内促进小鼠肿瘤接种模型的生长。乳腺癌的侵袭性行为的机制可能与miR-193b~DNAJC13或miR-193b~RAB22A轴有关。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

【共引文献】