携HSV-TK基因的纳米靶向阳离子脂质微泡增效治疗HIFU不全消融后残余肝癌的实验研究

发布时间：2018-12-12 17:05

【摘要】：原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,在我国肝癌的发病及致死率位居全球之首。目前肝癌的治疗方式有多种选择,手术切除仍是早期肝癌的主要治疗方式,但术后存在较高的复发率,且多数患者就诊时已为中晚期或终末期,丧失手术机会。目前我国对丧失手术机会的中晚期肝癌的治疗以射频治疗及经肝动脉介入栓塞化疗为主要方式,但其存在较多严重并发症且给患者带来较大痛苦。近年来,随着科学技术不断发展,高强度聚焦超声(HIFU)作为新的治疗手段已被广泛应用于临床,在众多肿瘤或非肿瘤性疾病的治疗中取得较好的效果。HIFU治疗的原理主要是通过超声波的热效应来杀灭病灶,但在临床治疗肿瘤时,由于肿瘤大多位于深部组织或器官,超声波穿透组织时不可避免的产生声能衰减,同时肿瘤区域的血供丰富,能量会随血液快速流动而衰减,这些因素都限制了HIFU治疗的彻底性,降低了HIFU疗效,从而导致了肿瘤组织不能完全被杀灭,增加了肿瘤复发的风险。相关研究表明肿瘤一旦复发,其侵袭能力较原发时明显增加。因此如何提高HIFU治疗效果,降低肿瘤的残留或复发成为目前研究热点。随着研究的进展,肿瘤的发生及进展与基因突变或缺失相关,因此基因治疗被广大学者认为是最具潜力的治疗方式。自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗中最有成效的方案之一,HSV-TK/GCV系统是自杀基因的一种,HSV-TK本身不具备杀伤功能,其转染进入细胞后可将无毒的GCV转化成细胞毒性物质进行杀伤。但如何将HSV-TK高效、安全、无创、无毒的转染进入组织细胞成为限制其发展的瓶颈。近年来,靶向超声微泡被广泛应用于基因的携载,载基因微泡注入体内后通过其表面靶向性配体、抗体与肿瘤组织受体特异性结合,从而在靶区域聚集,利用一定强度超声体表辐照使微泡破裂,从而释放携带目的基因,同时微泡破裂产生的空化效应及声孔效应,可促进细胞膜通透性增加,促进基因转染。因此,在本实验中,我们制备了纳米级阳离子微泡,并将肝癌特异性表达的GPC3抗体进行连接构建靶向阳离子微泡,然后再将HSV-TK质粒与靶向阳离子微泡连接,构建纳米携基因靶向阳离子微泡并检测其物理性能,通过体内、体外实验,探讨其靶向能力及HSV-TK/GCV系统对肿瘤的治疗作用。本课题包括以下三部分：第一部分携基因靶向超声微泡的制备第一节纳米微泡的制备及鉴定目的构建不同类型超声微泡用于携带目的基因。方法通过机械震荡法来构建不同的脂质微泡,其中阳离子微泡在成膜材料中加入DC-胆固醇(DC-cholesterol)使微泡表面带正电荷,以此来构建阳离子微泡(CMB),在光镜下观察各种微泡的基本形态及均一性,检测各种微泡的表面电位和粒径。结果各种微泡构建成功,光镜下观察两种微泡分布均匀,粒径大小均一,普通微泡表面电荷为-2.38±0.56 mV,呈微弱负电荷,阳离子微泡的表面电位为26.44±2.13 mV,普通微泡的粒径为512.57±25.18nm,阳离子微泡的粒径为502.63±21.26nm。结论两种微泡间相互比较,电位具有显著性差异(p0.01),粒径间比较,差异无统计学意义(p0.05)。第二节靶向微泡的构建及其性能检测目的将GPC3抗体及HSV-TK质粒与微泡连接,构建携基因靶向微泡。方法将制备好的阳离子微泡通过“生物素-亲和素”法与靶向抗体GPC3单抗进行连接,同时将阳离子微泡与同型对照抗体连接；构建成功的普通微泡、阳离子微泡、靶向阳离子微泡(5×108个)与质粒(HSV-TK)共孵育,利用静电吸附原理使二者充分结合,然后进行洗涤、离心,通过对未结合的质粒的量进行测定来检测不同类型微泡携带质粒能力,激光共聚焦显微镜检测质粒及抗体与微泡的连接情况。结果普通携基因微泡、阳离子携基因微泡、靶向阳离子携基因微泡及阳离子对照抗体微泡成功构建,激光共聚焦下连接成功的微泡大小均一,分散度较好,激光共聚焦显微镜下GPC3抗体与微泡连接后呈现绿色荧光,HSV-TK质粒与微泡连接后呈现红色荧光,二者原位重叠后呈现黄色荧光,表明成功构律靶向携基因微泡。普通徽泡、阳离子微泡和阳离子靶向微泡携带HSV-TK质粒的能力分别为0.36±0.03μg,17.91±1.15μg和17.26±2.01μg,两组阳离子微泡之间携带质粒的能力无统计学意义(P0.05),阳离子微泡与普通微泡之间比较,差异具有显著性(p0.01)。结论通过“生物素-亲和素”系统可以将纳米微泡、HSV-TK质粒及GPC3抗体成功连接,成功构建了纳米级靶向携基因微泡；阳离子微泡携基因能力明显大于普通微泡,阳离子微泡连接抗体后并不影响其携载能力。第二部分携HSV-TK基因的不同类型微泡寻靶和在超声作用下转染HEPG-2细胞的实验研究第一节携基因靶向微泡的体外、体内寻靶能力检测目的检测普通微泡、阳离子微泡及靶向阳离子微泡体外、体内靶向寻找HepG-2细胞的能力。方法(1)利用免疫组化法证实HepG-2细胞膜存在GPC3抗原表达；(2)利用自行设计的玻板进行HepG-2细胞培养,使细胞贴壁,然后将细胞已贴壁的玻板翻转并与微泡充分孵育后,再将玻板翻转,倒置显微镜下观察HepG-2细胞与微泡结合数,检测不同类型微泡的体外寻靶能力；(3)裸鼠皮下注射肝癌HepG-2细胞,建立裸鼠肝癌种植瘤模型,免疫组化法证实GPC3表达于肿瘤细胞表面。不同类型微泡经裸鼠尾静脉注射,通过超声肿瘤成像,检测其体内靶向肿瘤细胞能力。两部分实验中,对照抗体阳离子微泡作为阳离子靶向微泡的对照而纳入实验分组中,竞争抑制实验被用于证实靶向阳离子微泡与靶细胞的特异性结合。结果(1)免疫组化法证实HepG-2细胞表面存在GPC3抗原表达；(2)寻靶试验,除普通微泡外,阳离子微泡、靶向阳离子微泡、阳离子对照抗体微泡均可与表达GPC3抗原的HepG-2细胞结合,而阳离子靶向微泡与HepG-2细胞靶向结合数量最高(P0.01)；率先加入GPC3抗体孵育后,靶向阳离子微泡与HepG-2细胞结合数量明显降低(P0.01)；而细胞与同型对照抗体共孵育后,靶向阳离子微泡与HepG-2细胞结合数量没有明显影响(P0.05)；(3)体内试验中,超声证实：除靶向阳离子微泡外,普通微泡、阳离子微泡及阳离子对照抗体微泡均不能靶向结合表达GPC3抗体的肿瘤细胞；在超声显像的造影模式和传统灰阶模式下,与对照组相比,经普通微泡、阳离子微泡与靶向阳离子微泡注射后,种植瘤内均可见回声增强；且阳离子微泡组与靶向阳离子微泡组比普通微泡组回声更强,其中靶向阳离子微泡组回声最强。体内竞争抑制实验：通过裸鼠尾静脉注射GPC3抗体后,靶向阳离子微泡与肿瘤细胞靶向结合数量显著降低(P0.001)。结论(1)阳离子微泡、靶向阳离子微泡及阳离子对照抗体微泡均可与表达GPC3抗原的HepG-2细胞结合,但只有靶向阳离子微泡能与HepG-2细胞靶向结合,而阳离子微泡及阳离子对照抗体微泡与HepG-2细胞结合是非特异性结合,这种结合方式的优势在体内实验中不复存在；(2)超声显像也证实靶向阳离子微泡体内较好的寻靶效果,充分证实了靶向阳离子微泡体内、体外均具有较好的靶向能力。第二节超声作用下携HSV-TK基因的不同类型微泡转染HepG-2细胞的实验研究目的探讨在超声作用下普通微泡、阳离子微泡及靶向阳离子微泡转染HepG-2细胞的转染效率,以及转染后HSV-TK/GCV对细胞增殖抑制、肿瘤细胞侵袭的影响。方法实验分空白对照组、普通微泡组、阳离子微泡组、靶向阳离子组四组,将不同类型微泡连接HSV-TK质粒后,超声(1 MHz,1 W/cm2, and 50% duty cycle (DC),30 seconds)作用下转染HepG-2细胞,转染后检测转染效率,MTT检测细胞增殖抑制率,qPCR及Western分别检测TK、VEGF、 Caspase-3 mRNA及蛋白表达情况；通过体外HepG-2细胞侵袭实验评价细胞的侵袭能力。结果(1)转染24小时后各组的转染效率分别为0.31±0.05%,2.67±0.27%,21.38±2.04%,34.39±2.93%,各组间差异具有统计学意义(P0.01)；(2)转染后24小时行MTT检测细胞增殖抑制率,分别为8.25±0.93%,10.01±0.85%,42.36±3.87%,58.17±5.08%,靶向阳离子微泡组细胞增殖活性降低,组间比较差异亦具统计学意义(P0.01);(3) qPCR和Western检测：在阳离子微泡和靶向阳离子微泡组,TK和Caspase-3 mRNA及蛋白表达增加,而VEGF mRNA及蛋白表达下降,两组间比较差异具有统计学意义(P0.05)；(4)在肿瘤细胞侵袭实验中,各组迁移肿瘤细胞数目分别为：61.25±4.29、66.53±5.25、63.86±4.98、34.59±2.94、24.91±2.25,各组间比较差异具有显著性(P0.01)。结论阳离子微泡及靶向阳离子微泡组与对照组及普通微泡组比较,转染效率明显增高,其中靶向阳离子微泡组具有更高的转染率及其相应的生物学效应,可以明显抑制肿瘤细胞增殖及肿瘤细胞的侵袭。第三部分超声作用下携HSV-TK基因的不同类型微泡转染治疗HIFU不全消融后残余肝癌的实验研究目的探讨普通微泡、阳离子微泡及靶向阳离子微泡携HSV-TK质粒在超声作用下转染治疗HIFU不全消融HepG-2种植瘤效果,观察各组微泡对残癌组织生长的影响及治疗作用。方法(1)裸鼠左后肢皮下注射HepG-2细胞悬液建立种植瘤模型,造模后14天,裸鼠种植瘤模型建立成功,给予HIFU治疗,进行不全性消融,建立残癌模型；(2)随机分为4组,分别为对照组(经尾静脉注射生理盐水)、普通微泡组(经尾静脉注射普通微泡)、阳离子微泡组(经尾静脉注射阳离子微泡)及靶向阳离子微泡组(经尾静脉注射靶向阳离子微泡),每组微泡均已与HSV-TK质粒连接；(3)转染后行活体成像扫描,并应用图像分析软件评价寻靶效果；(4)寻靶成功后,普通微泡、阳离子微泡及靶向阳离子微泡各组在超声(1 MHz,2 W/cm2, and 50% DC,30 seconds)作用下转染肿瘤细胞,转染后予以GCV腹腔注射；(5)用免疫组化法检测肿瘤组织中TK、PCNA、CD31及VEGF的表达；并通过CD31的表达计算肿瘤细胞微血管形成情况,q-PCR检测TK. VEGF和caspase3mRNA表达；TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡；记录荷瘤裸鼠生存时间。结果(1)HE染色证实癌细胞残留,HIFU不全消融模型成功构建,微泡注入后行活体成像见残癌组织出现绿色荧光,HSV-TK质粒被成功转染进入组织细胞；(2)免疫组化及q-PCR结果显示除对照组外,各组均有TK蛋白表达,且阳离子靶向微泡组表达水平最高,再次证实HSV-TK基因成功转染进入肿瘤细胞内；(3)免疫组化及TUNEL结果显示靶向阳离子微泡组肿瘤增殖明显受到抑制(P0.01)、凋亡指数明显增高(P0.01),血管生成受到明显抑制(P0.05),生存时间明显延长。结论(1)载HSV-TK质粒的靶向阳离子微泡可以准确寻靶,同时联合超声可以促进质粒的释放及转染,提高转染效率,以达到靶向治疗残留肿瘤的效果；(2)HSV-TK/GCV系统可以使肿瘤增殖受到抑制、凋亡增加,血管生成及肿瘤侵袭均得到抑制,生存时间延长,可以显著的增强HIFU治疗的效果。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

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