肿瘤微环境对肿瘤预后及化疗耐药性的影响研究

发布时间：2018-12-14 01:43

【摘要】：背景及目的在全球范围内,食管癌的病死率高居第六位,是人类最常见的恶性实体肿瘤之一。尽管采用了包括手术、放疗和化疗在内的综合治疗,食管癌病人的五年生存率仅有20%左右。食管癌分为两大主要病理类型,分别是食管腺癌和食管鳞癌。我国属于食管癌高风险区域,且90%以上食管癌患者的病理类型为食管鳞癌。因此,对食管鳞癌发病和预后的相关研究意义重大。恶性实体肿瘤有以下两个主要构成部分：肿瘤实质和肿瘤间质。肿瘤间质(即肿瘤微环境)主要包括癌相关成纤维细胞(Cancer Associated Fibroblasts, CAFs),细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM),肿瘤相关巨噬细胞等。其中,肿瘤间质细胞,如CAFs等,能够与肿瘤实质细胞产生相互作用而促进肿瘤的生长、侵袭和转移,因而在近年来受到越来越多的关注。而Caveolin-1(小凹蛋白-1,Cav-1)蛋白被多项研究证明是介导肿瘤间质细胞和肿瘤实质细胞相互作用的关键因素之一。Cav-1是组成Caveolae的一种跨膜整合蛋白,可与包括酪氨酸激酶受体,G蛋白偶联受体等在内的信号分子结合并调节其活性,从而参与信号转导的调节。多项研究表明,Cav-1在肿瘤生长、侵袭和转移等方面是不可或缺的调节因子之一。而近期报道进一步表明,在肿瘤间质细胞与实质细胞的相互作用中,Cav-1具有重要的调节功能；且间质Cav-1蛋白表达缺失在多种肿瘤中与临床预后有明显的相关性。然而,食管鳞癌中Cav-1表达水平迄今为止极少有人研究,且其临床、病理意义也并不明确。所以,我们的研究目的是经免疫组化染色方法评估食管鳞癌实质和间质中的Cav-1蛋白表达水平,并分析其与患者临床病理因子及预后的关系。方法1.研究对象及随访研究的对象选取从2006年12月至2007年12月至我院胸外科行根治性切除术,并且术后证实为食管鳞癌的病人。排除其中术前曾行放疗／化疗,或术后30天内死亡的患者,最终入组患者110例,包括89例男性患者,21例女性患者。通过医院电子病案系统获取所有入组病人的临床资料,进行回顾性分析,并根据American Joint Committee on Cancer Staging Manual (7th ed,2010)明确其TNM分期。随访工作自手术结束当天开始,持续至2013年1月或者病人死亡为止。中位随访时间49.2个月(范围,3.5-72.9个月)。每位病人手术结束后两年之内每隔三个月进行一次常规体格检查和病史回顾,2年后检查周期改为每隔6个月一次。癌相关血液指标复查视情况而定,每三或五个月一次；如有必要时可行影像学检查。所有参与实验的病人均已获知实验内容,并且签署了知情同意书；本实验的所有步骤均经过仔细审查,并且获得了山东大学齐鲁医院伦理委员会批准。2.病理标本处理及免疫组化染色所有入组病人肿瘤标本由本院病理科获取,固定、石蜡包埋后制作厚度5gm左右的病理切片。所有病人的切片用Cav-1抗体作免疫组织化学染色并在染色过程中设置相应的阳性和阴性对照。3.染色结果分析首先在显微镜低倍镜(放大倍数100倍)下经过初步评估筛查出10个着色较明显的视野,然后在高倍镜(10*40)下,分别对Caveolin-1蛋白表达阳性的肿瘤细胞(tumor cells, T)和肿瘤间质细胞(stromal cells, S)进行计数。然后根据计数行Caveolin-1蛋白表达级别判定并加以统计。统计结果由两位互相独立的病理学人员分别加以分析。结果Cav-1在肿瘤实质和间质细胞的胞浆及胞膜上均有一定量的表达。肿瘤实质Cav-过表达率37.3%,与肿瘤浸润深度相关(p=0.038)。肿瘤间质Cav-1低表达率40.9%。间质Cav-1低表达组的淋巴结转移及局部复发发生率均明显高于间质Cav-1高表达组(p值分别为0.020和0.002)。除此以外,肿瘤间质Cav-1低表达组病人的无病生存率(DFS,p0.001)和总生存率(OS,p0.001)均明显低于间质Cav-1高表达组。多因素分析表明,肿瘤间质Cav-1表达下调是食管鳞癌病人无病生存率(DFS)和总生存率(OS)的独立预测因子(p值分别为0.028和0.007)。结论对食管鳞癌而言,间质Cav-1表达下调者其恶性程度更高。间质Cav-1表达下调预示着淋巴结转移及局部复发风险更高,病人不良预后可能性更大。背景及目的近期多个报道提示,在多种恶性实体肿瘤的微环境中,M2样巨噬细胞数目与M1样巨噬细胞数目的比例与病人的预后有明显的相关性。但在食管鳞癌中,以上两种细胞对于病人生存情况的影响尚没有人探索。我们实验通过长期随访食管鳞癌病人并标记不同极性的巨噬细胞,来评估M2/M1比的临床病理意义,以达到检测这一比例对病人预后预测价值的目的。方法收集110例食管鳞癌病人的病理切片作免疫组化,以CD40作为M1样巨噬细胞的标记物,以CD163作为M2样巨噬细胞的标记物。在显微镜下分别计数M1样巨噬细胞数目和M2样巨噬细胞的数目,然后计算出每个病例的M2/M1比例。通过随访获得所有病人对应的预后情况,最后分析M2/M1比与病人临床病理因子之间的关系和对预后的预测价值。结果在M1样巨噬细胞计数和M2样巨噬细胞计数与食管鳞癌预后之间不存在显著的相关性。高M2/M1比的病人发生淋巴转移的风险和局部复发风险显著升高。高M2/M1比组患者和低M2/M1比组患者的中位生存期(MST)分别为25.4个月(范围3.5各个月-102.3个月)和62.8个月(范围7.5个月-103.9个月)。Kaplan-Meier分析表明高M2/M1比与更低的5年总生存率(p0.001)和更低的5年无病生存率(p0.001)。最后,此实验的多因子分析结果显示,M2/M1比是5年总生存率(p=0.016)和5年无病生存率(p=0.010)的独立预测因子。结论在食管鳞癌病人中,高M2/M1比与淋巴转移和局部复发显著相关。高M2/M1比可以作为食管鳞癌不良预后的较为可靠的预测因子。背景及目的尽管拥有手术、放疗、化疗、激素治疗和靶向治疗等诸多治疗手段,乳腺癌,尤其是复发性乳腺癌致死率依旧居高不下,成为危害女性生命和健康的重要风险因素。在乳腺癌治疗过程中,多次治疗后肿瘤产生耐药性是造成治疗效果难以改善的重要阻碍。乳腺癌耐药性的研究有很多,而之前的许多研究者将研究重点放在乳腺癌细胞本身在治疗过程中产生的基因突变等因素,试图以此解释乳腺癌对药物抗拒作用的产生机制。此类研究虽然取得了很多成果,如发现了乳腺癌易感基因、促进了乳腺癌靶向药物的研发等,但迄今为止,这些发现并未从根本上解决乳腺癌的耐药问题。这一现象说明,乳腺癌耐药性产生的机制比研究者预期的要更加复杂,通过单纯针对乳腺癌细胞本身的研究来寻找乳腺癌耐药性产生的答案遇到了瓶颈。肿瘤微环境是恶性实体肿瘤不可忽视的一部分。通过分泌诸多信号因子以及与肿瘤细胞的直接接触,肿瘤微环境对肿瘤的生物学行为有着不可或缺的影响。近年来,多项研究表明,肿瘤微环境中的信号可以促进肿瘤细胞经受化疗打击后保持存活。Mikala Egeblad等人更是将这一过程用活体实时成像技术加以呈现。但是,肿瘤微环境对乳腺癌耐药性的产生有什么影响,影响的机制又是什么?以上问题目前并没有清楚的答案。多项报道已经证明,耐药的肿瘤细胞通常是低分化肿瘤细胞。我们在Egeblad实验室的前期研究发现,对于敲除趋化因子C-C基元受体2(chemokine C-C motif receptor 2, CCR2)基因的转基因小鼠,其体内复发的乳腺癌癌细胞分化程度显著好于对照的野生型小鼠。这一发现证明,肿瘤微环境中的CCR2通过某种机制可以影响复发肿瘤细胞的分化,进而可能影响肿瘤耐药性的产生。我们进一步筛查,发现了受CCR2影响而表达发生明显变化的多个基因。在这些基因中,多药及毒素外转运蛋白1(Multidrug and toxin extrusion protein 1, MATE 1)及GATA结合蛋白3(GATA binding protein-3)最受我们关注。MATE1是一种外转运蛋白,可以将细胞内的阳离子化合物(包括顺铂等阳离子化疗药)运出细胞外。而GATA3则对乳腺癌细胞的分化、预后及转移等有着明显的影响。二者均受肿瘤微环境中CCR2的调控,且可能与乳腺癌耐药性的产生相关,值得进一步研究。本研究的目的为在前期研究基础上,对MATE1及GATA3对乳腺癌耐药性产生的机制加以探索,从而为克服肿瘤耐药性提供可供选择的新靶点,进而可能改善乳腺癌患者治疗效果。方法1. MATE1抑制剂对阿霉素耐药性的影响实验取Cal-51和MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,两种细胞系均被分为对照组、单独加MATE1抑制剂(乙胺嘧啶)组、单独加盐酸阿霉素组和同时加MATE1抑制剂和盐酸阿霉素组。药物处理48小时之后,每组均作MTS实验,测各组细胞经药物处理后的存活情况,从而评估MATE1抑制剂对阿霉素耐药性的影响。2. MMTV-PyMT转基因小鼠复发乳腺癌MATE1表达情况评估获取8周雌性MMTV-PyMT转基因小鼠10只,将这些小鼠随机分配到实验组和对照组。每组各5只。实验组小鼠三次盐酸阿霉素治疗,每周一次；对照组小鼠则给予相同剂量的1xPBS。阿霉素化疗结束后,继续随访三周,随后处死仍然存活的各组小鼠,取出复发的肿瘤组织,处理后用石蜡包埋。此后用获取的复发肿瘤组织作切片,并作免疫组化染色,以观察复发乳腺癌细胞MATE1表达情况。3. GATA3过表达乳腺癌细胞系的构建获取小鼠乳腺癌细胞系Py2T细胞系以及人乳腺癌细胞系Ca151细胞系。提取人及小鼠pBabePuro-GATA3质粒后,对Ca151细胞及Py2T细胞作pBabePuro-GATA3质粒逆转录病毒转染并用嘌呤霉素筛选。用pBabePuro空质粒作同样程序的转染,得到对照组,即乳腺癌细胞空白质粒对照组。然后用Western Blot检测各组GATA3表达情况,以确定GATA3过表达细胞系构建成功。4. GATA3过表达组乳腺癌细胞形态及增殖速度观察显微镜下观察Ca151 GATA3过表达组细胞和Py2T GATA3过表达组的细胞相对于各自对照组的形态变化,并作GATA3过表达组肿瘤细胞增殖速率测量。5. GATA3过表达组乳腺癌细胞加药实验Cal51 GATA3过表达组细胞和Ca151空白质粒对照组细胞各分为对照组(加PBS)、加顺铂组和加盐酸阿霉素组。按以上分组做MTS实验,统计各组细胞增殖数据,观察GATA3过表达对乳腺癌细胞的耐药性的影响。6. MMTV-PyMT转基因小鼠乳腺癌化疗后GATA3表达情况检测获取雌性MMTV-PyMT转基因小鼠15只,将所有小鼠按照随机原则分为对照组,盐酸阿霉素组,顺铂组,每组各5只。按以上分组每周经腹膜下给药一次,一共三次。三周后停止给药,不做任何处理并继续随访三周。然后处死仍然存活的小鼠,取出乳腺癌组织,作肿瘤组织切片。最后用RNA原位杂交技术来检测MMTV-PyMT转基因小鼠乳腺癌化疗后GATA3表达情况的变化。结果1. MATE1抑制剂对乳腺癌对药性抗拒性的作用经MATE1抑制剂处理48小时后,Ca151细胞和MDA-MB-231细胞增殖速度均显著降低,且随着MATE1抑制剂浓度增加而抑制作用增强；但MATE1抑制剂与阿霉素联合应用后,抑制乳腺癌细胞增殖的趋势与只采用阿霉素组相比,并没有明显的增强。2.化疗后复发的乳腺癌组织MATE1表达情况免疫组化结果显示：MATE1主要在乳腺癌细胞的细胞膜上表达,且化疗后复发组与对照组之间的MATE1染色H评分并无显著差异。3.GATA3过表达乳腺癌细胞的形态及增殖速率变化Cal51 GATA3过表达组及Py2T GATA3过表达组细胞较空白质粒对照组细胞形态变化明显：GATA3过表达组细胞形态更倾向于基底细胞样,而Ca151空白质粒对照组细胞则更倾向于管腔上皮细胞样。另外,GATA3过表达组细胞增殖速率对照组显著下降。4.体外实验GATA3过表达对乳腺癌细胞化学治疗效果的影响体外试验中,经阿霉素处理后,Cal51 GATA3过表达组细胞与对照组的数量变化并无显著差异；而经顺铂处理后,Cal51 GATA3过表达组细胞存活比例显著高于对照组。5.化疗后复发乳腺癌组织中GATA3表达的变化阿霉素化疗后复发的乳腺癌组织中GATA3表达较对照组明显上调(P=0.034),而顺铂化疗后复发的乳腺癌组织中GATA3表达情况则无显著变化。结论MATE1与我们预期的并不一样,对于乳腺癌对药物抗拒性的产生无显著影响；GATA3的上调则对乳腺癌细胞对阳离子化疗药的耐药性产生有促进作用,且化疗后复发的乳腺癌细胞中GATA3表达显著上调。但GATA3影响乳腺癌细胞耐药性的具体机制仍不清楚,需要大家继续去探索,以明确其下游信号通路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5

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