【摘要】：背景：肝癌(liver cancer)是全球第二大癌症死因,全球大约50%肝癌患者在中国,其中肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)最为常见,这严重危害了人民群众的健康。流行病学及已有的研究资料表明,乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)感染、黄曲霉素和酒精等与肝细胞肝癌的发病相关。随着分子生物学研究的进展,肝癌发生发展的机制被进一步认识。目前普遍认为肝癌的发生是包括原癌基因激活和抑癌基因失活在内的多步骤多阶段的过程。研究肝癌发病的分子机制,发现有效的治疗靶点,对进一步预防和治疗肝癌具有重要的意义。目前的基因组学研究确定了一些肝细胞肝癌中频繁突变的基因,2012年在Nature Genetics先后有3篇文章报道了肝细胞肝癌的基因组测序结果,发现肝癌标本中CTNNB1、AXIN1、P53以及ARID1A有较高的突变率。关于CTNNB1、AXIN1、P53及相关通路在肝癌发生发展中的作用已有较多研究。但是,ARID1A在肝癌发生中的作用和机制尚不清楚,亟待进一步研究。目的：本课题旨在研究ARID1A基因失活性突变(inactivation)在肝癌发生中的作用。在不同的动物模型中,敲除Arid1a,观察是否能导致或者加速肝癌的发生。在此基础上,通过体内外实验,探索ARID1A失活性突变加速肝癌发生的可能机制。方法：1.构建用于敲除ARID1A的CRISPR-Cas9系统。2. 以C57BL/6J小鼠为对象,通过尾静脉高压注射将带有靶向敲除Arid1a的sgRNA的CRISPR-Cas9质粒注射入肝脏,在正常小鼠肝脏中敲除Arid1a,研究Arid1a突变是否能直接导致肝癌的发生。3. 以C57BL/6J小鼠为对象,利用CRISPR-Cas9基因敲除系统和尾静脉高压注射技术,在正常小鼠肝脏中联合敲除Arid1a、Pten、P53三个基因,和敲除Pten.P53的肝癌模型比较,研究Arid1a突变对肝脏肿瘤产生的影响。4.在DEN诱导小鼠肝癌模型中,利用CRISPR-Cas9基因敲除系统和尾静脉高压注射技术,敲除Arid1a,和对照的DEN肝癌模型组比较,研究Arid1a突变在这种动物模型中对肿瘤产生的影响。5.在人肝癌细胞系Be17404中运用CRISPR-Cas9技术,敲除ARID1A,获得ARID1AKO的细胞系,通过RNAseq比较基因转录组差异。6.通过CCK-8细胞活力实验和裸鼠皮下成瘤实验,比较ARID1A KO细胞系和野生型的Be17404细胞系在细胞增殖方面的差异。7.用免疫组织化学染色法,检测ARID1A在临床肝癌病人标本中的表达,区分ARID1A阳性和阴性的病人,通过Kaplan-Meier生存曲线比较总生存率和无瘤生存率。8.运用共聚焦荧光显微镜观察ARID1A KO的细胞,探索ARID1A缺失对细胞有丝分裂的影响。9.用细胞周期阻断药物MG132、Nocodazole处理野生型Be17404细胞系,分析细胞周期不同阶段(M期、G2期)ARID1A表达量的差异。10.流式细胞分析比较ARID1A KO细胞系和野生型Be17404细胞系的细胞体倍数以及同步化释放后细胞周期的差异。11.对ARID1A KO的肝癌细胞系进行IR、UV、顺铂处理,Western blot检测r-H2A.X的变化,探索ARID1A缺失对细胞DNA损伤修复过程的影响。12.在体内外用IR照射野生型Be17404和ARID1A KO细胞系,Western blot检测Cleaved-PARP,免疫组织化学染色Cleaved-Caspase-3,比比较细胞对IR诱导的凋亡的反应。结果：1.在体内外CRISPR-Cas9系统可以靶向性的敲除目的基因。2.在成年的C57BL/6J小鼠肝脏中单独敲除Arid1a,长期观察未见肿瘤发生,但有更多P-Histone-H3染色阳性的肝细胞,有更多r-H2A.X染色阳性的肝细胞。3.在成年的C57BL/6J小鼠肝脏中联合敲除Arid1a、Pten、P53三个基因,和敲除Pten、P53的小鼠比较,肿瘤更快发生,3个月肝脏表面可见异常结节。4.在DEN诱导的肝癌模型中,敲除Arid1a和对照的DEN模型组比较,肿瘤更快发生,6个月肝脏表面可见小肿瘤。5.运用CRISPR-Cas9技术,成功构建ARID1A KO的Be17404细胞系。通过Western blot、TA克隆测序、细胞免疫荧光、裸鼠皮下成瘤后的组织石蜡切片免疫组化染色确证。6.体外CCK-8实验、裸鼠皮下成瘤实验,均提示ARID1A KO和野生型的Be17404细胞系增殖能力无明显差异。RNAseq结果提示一些重要的控制增殖的基因转录水平无明显差异。7.肝癌组织标本免疫组织化学染色,ARID1A阴性的病人占12.17%(14/115),阳性和阴性的病人总生存率和无瘤生存率无显著性差异。8.运用共聚焦荧光显微镜观察ARID1A KO细胞,发现ARID1A缺失时细胞有丝分裂后期会出现“藕断丝连”的染色体分离异常。运用不同的细胞周期阻断药物处理野生型Be17404细胞,发现ARID1A在细胞周期不同阶段的表达量不同。流式细胞分析ARID1A∞的细胞更多停留在G2/M四倍体期。进一步用double thymidine同步细胞在G1期,释放后,发现ARID1A KO的细胞更快进入G2/M期。9.对ARID1A KO和野生型Be17404肝癌细胞系用IR、UV、I质铂处理,以r-H2A.X作为DNA损伤修复的标志,发现ARID1A KO的细胞系,r-H2A.X的产生受到抑制。免疫共沉淀发现ARIDIA和r-H2A.X之间存在相互作用。10. ARID1A KO细胞系比野生型的Be17404细胞系更加耐受IR照射,Western blot检测Cleaved-PARP的产生受到抑制。裸鼠皮下成瘤后接受IR照射,免疫组织化学染色发现ARID1A KO细胞和野生型的Be17404细胞相比Cleaved-Caspase-3的产生受到抑制。结论：1.在小鼠中,Arid1a的突变虽不能直接导致肝脏肿瘤的产生,但是在不同肝癌模型中都能加速肿瘤的发生。2. ARID1A的缺失不影响肝癌细胞的增殖能力,对肝细胞肝癌的病人预后无明显影响。3. ARID1A的失活性突变使细胞有丝分裂后期会出现“藕断丝连”的染色体分离异常,可能导致异倍体,和肿瘤的产生有密切关系。4. ARID1A失活性突变的细胞DNA损伤修复出现问题,表现在无法诱导产生r-H2A.X,容易产生基因组不稳定性,和肿瘤的产生有密切关系。5. ARID1A失活性突变的细胞能抑制IR诱导的凋亡,在肿瘤的发生过程中可能有一定作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
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本文编号：2383686
