PKM2对谷氨酰胺代谢和线粒体损伤的调控机制及白藜芦醇的干预作用

发布时间：2018-12-18 06:01

【摘要】：为应对缺氧和低营养条件的肿瘤微环境,肿瘤细胞往往发生能量代谢的改变,即“代谢重编程”。主要表现在两个方面:有氧糖酵解和对谷氨酰胺的高度依赖。肿瘤细胞通过代谢重塑为其生物合成提供大量的中间代谢产物,表明代谢重编程在肿瘤恶性转化过程中举足轻重的作用。肿瘤细胞的葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢途径均受到复杂的信号转导途径的调控,因此探讨这两种代谢途径间的调控关系及其产生原因,将为以肿瘤代谢为靶点的肿瘤治疗提供理论基础。近年来,随着人们对肿瘤细胞能量代谢重塑的深入研究,发现M2型丙酮酸激酶(M2 type pyruvate kinase,PKM2)在糖酵解过程中扮演着关键角色。PKM2是糖酵解途径中将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化成为丙酮酸和ATP的限速酶。已知PKM2在肿瘤细胞中特异性高表达,在协调肿瘤细胞葡萄糖相关代谢途径(包括糖酵解、磷酸戊糖和丝氨酸合成途径)中发挥关键作用,但PKM2是否参与谷氨酰胺代谢及线粒体功能调控却鲜为人知。本研究探讨了PKM2与谷氨酰胺代谢及线粒体功能调控之间的关系,并对其分子机制进行深入研究,为以代谢为靶点的肿瘤治疗提供新思路;进一步以PKM2作为肿瘤治疗的靶点,探讨了白藜芦醇对PKM2的干预作用及分子机制,同时拓展了白藜芦醇的药用价值。本研究获得的主要研究结果如下:(1)探讨PKM2与谷氨酰胺代谢之间的关系及其分子机制。研究结果表明,PKM2稳定敲低能够增加谷氨酰胺酶Gls1、Gls2,谷氨酰胺转运受体SLC1A5及其上游转录因子β-catenin、c-Myc的表达,而PKM2过表达可抑制其表达,表明β-catenin/c-Myc信号通路介导PKM2对谷氨酰胺代谢的调控。放线菌素D实验显示,PKM2上调β-catenin的表达主要是通过调控其转录水平,而不是通过抑制mRNA降解。检测PKM2不同点突变细胞株中β-catenin的表达,发现R399E突变细胞能明显抑制β-catenin的表达,即二聚体形式的PKM2发挥关键作用。PKM2过表达上调miR-200a的表达,miR-200a可与β-catenin的3’UTR结合抑制β-catenin的表达。(2)探讨PKM2与线粒体功能之间的关系。采用线粒体探针标记PKM2过表达及敲低的细胞中的线粒体,显微镜观察发现PKM2过表达的细胞中线粒体围绕细胞核分布,融合线粒体的比例升高,线粒体数量减少。而PKM2敲低后,线粒体分裂为更小的单位,数量增多。qPCR和western blot结果显示PKM2过表达后,线粒体分裂蛋白Drp1表达减少,融合蛋白Mfn2表达升高;PKM2敲低后,Drp1表达升高,Mfn2表达降低;同时,PKM2过表达导致ATP生成量减少,线粒体DNA拷贝数增加,电子传递链复合物的表达下降。(3)探讨PKM2通过Drp1调控线粒体动态平衡的分子机制。研究结果显示PKM2过表达能够在蛋白水平抑制p53表达,PKM2敲低促进其表达,而对p53mRNA水平没有影响。采用p53 siRNA处理细胞后,Drp1随p53表达的下降而下降,表明PKM2能够通过p53调控Drp1的表达。蛋白稳定性实验提示,PKM2过表达促进了p53通过蛋白酶体途径降解,而PKM2敲低可增加p53蛋白的稳定性,该过程是通过MDM2介导的p53泛素化实现的。免疫共沉淀及GST pull-down实验表明,PKM2与p53、MDM2存在相互作用,推测PKM2与MDM2可结合到p53不同的结构域形成三元复合物促进p53的泛素化,进而通过蛋白酶体途径被降解。免疫组化检测宫颈癌病人临床样本中PKM2和Drp1的表达,结果显示PKM2与Drp1的表达呈负相关,这与细胞水平得到的结果是一致的。(4)探讨PKM2通过Mfn2调控线粒体动态平衡的分子机制。研究表明PKM2过表达能够抑制miR-106b的表达。双荧光素酶报告实验显示miR-106b可以直接靶向Mfn2 3’UTR,进而抑制Mfn2的表达。采用miR-106b模拟物转染细胞后,发现Mfn2的表达水平显著降低,融合线粒体的数量及mtDNA拷贝数减少,ATP生成量升高。免疫组化检测乳腺癌病人临床样本中PKM2和Mfn2的表达,结果显示PKM2与Mfn2的表达呈正相关,这与细胞中所得结果是一致的。(5)探讨白藜芦醇对PKM2的干预作用及分子机制。研究发现白藜芦醇能够通过靶向抑制PKM2的表达发挥其抗肿瘤活性。白藜芦醇处理后导致线粒体分裂成更小、更多的线粒体,且Drp1和Fis表达明显升高,Mfn2的表达显著下降,PKM2过表达可逆转这一现象;另外,内质网应激的关键分子GRP78、CHOP和Caspase12显著上升,PKM2过表达后其表达明显逆转。检测PKM2敲低的稳定细胞株中上述指标的表达,发现内质网应激指标及线粒体分裂蛋白表达上调,线粒体融合蛋白表达下降。以上结果表明PKM2介导的内质网应激和线粒体分裂参与白藜芦醇诱导的细胞凋亡。双荧光素酶报告实验显示miR-326可直接与PKM2的3’UTR结合,进一步实验结果表明白藜芦醇能够通过上调miR-326有效抑制PKM2的表达。综上所述:PKM2缺失可通过激活β-catenin/c-Myc信号通路促使谷氨酰胺代谢发挥代偿作用。PKM2一方面通过p53/Drp1轴抑制线粒体分裂,另一方面通过miR-106b/Mfn2轴促进线粒体融合,最终引起线粒体过度融合、功能受阻。白藜芦醇可通过上调miR-326干预PKM2的表达,引发内质网应激和线粒体分裂,从而诱导细胞凋亡。鉴于PKM2在肿瘤代谢及肿瘤生长中的重要作用,PKM2有望作为一个有效的肿瘤治疗靶点,同时发现白藜芦醇对体内PKM2的表达有明显的抑制作用,拓展了白藜芦醇的药用价值。
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【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.5

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