人类抑癌蛋白p53诱导酵母细胞凋亡的研究

发布时间：2018-12-31 09:01

【摘要】：目的:在酵母细胞中异体表达人类抑癌蛋白p53并探讨利用酵母检测p53功能的可能性。方法:以乳腺癌细胞株MCF-7(含野生型p53)的RNA逆转录产物cDNA为模板,经PCR扩增野生型p53基因并克隆于受半乳糖诱导的酵母表达质粒pRS426Gal1/10中,使用定点突变构建突变型p53(R248W、G245S、R273H和R249S),经测序确认后质粒转化到酵母细胞,观察p53诱导表达后酵母细胞的凋亡和生长状况。利用蛋白印迹(Western blot)检测不同诱导时间p53的表达,应用原位末端标记法(TUNEL)检测DNA断裂、Annexin V-FITC/PI法检测细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻指示细胞凋亡。结果:野生型p53诱导3小时后酵母菌即出现生长抑制,诱导9小时后可检测到p53表达,并随时间延长表达增加,生长抑制更甚,酵母细胞出现典型的凋亡表型。而表达突变型p53(R248W、G245S、R273H和R249S)的酵母细胞则未观察到明显的凋亡和生长抑制。结论:酵母可异体表达人类抑癌蛋白p53,依据酵母细胞的生长状况可反映p53诱导细胞凋亡的功能。
[Abstract]:Aim: to express human tumor suppressor protein p53 in yeast cells and explore the possibility of detecting p53 function by yeast. Methods: the RNA reverse transcription product (cDNA) of breast cancer cell line MCF-7 (containing wild type p53) was used as template, and the wild type p53 gene was amplified by PCR and cloned into the yeast expression plasmid pRS426Gal1/10 induced by galactose. The mutant p53 (R248WN G245SN R273H and R249S) was constructed by site-directed mutation. The plasmid was transformed into yeast cells by sequencing. The apoptosis and growth of yeast cells induced by p53 were observed. Western blot (Western blot) was used to detect the expression of p53 at different induction time, in situ end labeling (TUNEL) was used to detect DNA fragmentation, and Annexin V-FITC/PI method was used to detect cell membrane phosphatidyl serine valgus (Phosphatidyl serine valgus) indicating cell apoptosis. Results: three hours after induction of wild type p53, the growth inhibition appeared in yeast, and the expression of p53 was detected after 9 hours of induction. The expression of p53 increased with time, and the growth inhibition was more serious. The typical apoptotic phenotype appeared in yeast cells. But the yeast cells expressing mutant p53 (R248WN G245SU R273H and R249S) showed no obvious apoptosis and growth inhibition. Conclusion: yeast can express human tumor suppressor protein p53 in vivo, which can reflect the function of p53 induced apoptosis according to the growth status of yeast cells.
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.2

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本文编号：2396357