转录因子RUNX2在胃癌侵袭转移中的作用及其分子机制探究

发布时间：2019-01-04 20:59

【摘要】：尽管近年来发病率有所降低,在全球范围内,胃癌依旧是致死率全球第五的高度恶性的肿瘤。尽管消化道内镜检查已引入到胃癌早期临床诊断过程中,仍有65%的患者首诊就发现有胃癌的侵袭和远处转移,且进展期胃癌患者的5年生存率低至5%-15%。侵袭与转移、术后复发和多药耐药均被认为是胃癌患者预后不良,术后生存时间短的重要原因。胃癌,这一消化道恶性肿瘤的诸多恶性生物学行为其背后的分子机制至今仍不清楚。而报道已证实,转录因子RUNX2参与促进多种易发生骨转移肿瘤的侵袭与转移行为的发生,同时,我们的实验发现RUNX2在胃癌干细胞中高表达,因此,我们的研究旨在揭示RUNX2在促进胃癌细胞恶性生物学行为及其分子机制。经大样本临床免疫组化检测分析发现,RUNX2是胃癌患者预后的一个极为重要的提示因子。与此同时,一系列的体外实验和原位移植瘤动物模型的数据证实,RUNX2是维持胃癌细胞移植瘤成瘤及侵袭转移等恶性行为的重要因子。因此,为了明确此作用内在的分子机制,我们进行了染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告实验,结果证实,转录因子RUNX2的转录激活位点落在CXCR4的启动子区上。CXCR4是RUNX2下游极为重要的靶基因,在胃癌中,RUNX2主要通过激活CXCR4的转录和表达,发挥促进胃癌细胞侵袭与转移的作用。接着,我们通过采用慢病毒干扰下调CXCR4或添加AMD3100处理的方法,在RUNX2高表达的情况下抑制CXCR4信号通路的活化。由此,我们通过体内外的实验证实,抑制CXCR4信号通路的活性可逆转由RUNX2所介导促侵袭转移的作用。因此,RUNX2可作为一个有价值的临床肿瘤诊疗因子,可预示患者的预后,同时RUNX2/CXCR4通路的揭示为我们提供了第一手实验室证据,是今后针对该通路进行的靶向药物研发的重要依据。主要方法,研究结果和结论如下:1.RUNX2在胃癌干细胞和胃癌细胞中的表达。(1)通过比较成球状态胃癌细胞和单层培养的胃癌细胞的DNA表达谱芯片结果后发现,RUNX2在成球状态胃癌细胞中显著高表达50余倍。通过无血清成球培养法,常被认为是富集胃癌干细胞(GCSCs)的主要方法。(2)基于以上基因芯片结果,我们采用GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)方法进行生物信息学分析,发现,以RUNX2为核心的一群基因簇群(共同代表着一类生物学功能)在胃癌干细胞中为显著活化的状态,在gsea中获高的富集得分。(3)通过免疫荧光染色观察后发现,runx2在成球培养的胃癌细胞中高表达。(4)与此同时,runx2在sgc7901,mgc803和xn0422中均被检测后发现,runx2在sgc7901细胞中低表达,在mgc803和xn0422细胞中显著高表达。2.胃癌中,runx2的表达与胃癌临床病理参数和患者的预后密切相关。(1)共305例有完全随访信息的胃癌病理标本的免疫组化发现,runx2与临床病理参数,如tnm分级、分化程度、淋巴转移和侵润深度正相关。runx2主要定位在胃癌细胞核内,仅少部分表达呈现胞核胞浆同时表达,且在不同分化程度的胃癌中,其表达具有统计学意义(p=0.006)。在81例高/中分化胃癌中,有49例(60.5%)的患者高表达runx2,这一比例在低分化胃癌病例中,runx2高表达比例占总群体的76.3%(171/224)。同时,runx2的高低表达与胃癌患者的tnm分期正相关(p=0.000)。在tnmi期和ii期的共124位胃癌患者中,有49位患者被检测出具有runx2的低表达(49/124,39.5%),75例患者则为runx2的高表达(75/124,60.5%)。然而,在181例tnmiii期和iv期的胃癌患者人群中,有145例患者表现出runx2高表达(145/181,80.1%)。此外,runx2的高表达还与淋巴结转移(p=0.000)和深部浸润(p=0.000)相关。在有淋巴结转移的胃癌患者中,大约79.3%的患者被检出runx2高表达(161/203)。而在发现浆膜浸润的胃癌患者中,超过79.1%的患者有runx2的高表达(178/225)。最后,runx2的表达与患者的年龄(p=0.352)和性别(p=0.480)无关。(2)比较胃癌癌组织和癌旁组织runx2的表达也发现,在癌组织中,runx2高表达的比例为72.1%(220/305),而癌旁组织该比例仅为21.6%(66/305)(p=0.00);(3)在305例胃癌病例中,有220例呈runx2高表达状态。高表达的胃癌患者群体总体预后不良,术后生存时间短。runx2低表达的患者预后好,有较长的术后生存期。以上研究证实,runx2表达水平提示胃癌患者的总体预后;(4)通过多因素分析的方法发现,runx2表达(hr3.454,95%ci1.408-8.230,p=0.007),与淋巴转移(hr1.539,95%ci1.089-2.591,p=0.045)和侵润深度(hr1.620,95%ci1.022-2.567,p=0.040)共同预示患者的预后情况,数据显示tnm分期(hr1.293,95%ci0.846-1.975,p=0.235)和分化程度(hr0.704,95%ci0.488-1.016,p=0.061)这一指标似无作用,分析原因可能为采集的样本例数较少。.3.runx2促进胃癌细胞移植瘤成瘤及体内外侵袭转移。(1)runx2参与胃癌移植瘤成瘤能力维持。通过将胃癌细胞系移植于裸鼠皮下,进行移植瘤成瘤实验证实,在稳定上调runx2表达的胃癌细胞株sgc7901-exrunx2中,其皮下移植瘤成瘤能力显著增强。移植瘤重量与大小的统计分析结果也证实了以上结论。(2)runx2促进胃癌细胞侵袭和转移。体外细胞划痕实验用于评估胃癌细胞的平面迁移运动能力。试验结果证实,在sgc7901中稳定上调runx2后,肿瘤细胞迁移的距离远大于对照组细胞(control)。而在mgc803和原代细胞xn0422中稳定敲低runx2的表达后,细胞迁移距离缩短,提示迁移能力受损。侵袭实验也证实,runx2的表达与细胞体外侵袭能力正相关。同时,汇总综合国内外文献的方法,基于胃癌发生发展的规律,改良了胃癌原位移植瘤的裸鼠模型,并通过该动物模型证实,runx2上调后,胃癌细胞在胃部的局部侵袭能力显著增强,可向邻近肝脏转移。稳定敲低runx2后,胃癌细胞的局部侵袭与肝脏转移能力显著受损。因此,runx2在体内外均促胃癌细胞侵袭与转移。4.转录因子runx2直接转录激活cxcr4基因。(1)通过采用转录因子生物信息学分析预测对与侵袭转移相关的基因进行评分后发现,cxcr4的得分最高(11.462)。通过real-timepcr在mgc803和原代细胞xn0422中对与肿瘤侵袭转移密切相关的基因进行筛选后发现,cxcr4差异倍数最高,且是两种细胞中均降低的分子。肿瘤侵袭转移相关基因包括,mmp家族成员,趋化因子受体cxcr4以及emt现象相关基因,其中,mmps在诸多肿瘤,如骨肉瘤,乳腺癌和前列腺癌中被报道是runx2的下游靶基因。(2)通过染色质免疫共沉淀实验发现,在cxcr4启动子区上存在一段277碱基的片段,高度疑似runx2的转录结合位点。(3)基于生物信息学预测的结果所提示的15bp的片段,我们设计了突变型的荧光素酶报告载体。荧光素酶报告试验及后续的凝胶电泳迁移率试验证实,这15个碱基的片段,正是转录因子runx2在cxcr4基因启动子区结合的位点。(4)与此同时,我们还对之前ch-ip试验所明确的277个碱基片段进行50个碱基的递增分段截短构建相应的荧光素酶报告载体,后续的荧光素酶报告试验证实第一个被截短的50个碱基内存在runx2的结合位点。而这一结论,与先前的试验结果相一致。(5)最后,wb检测发现,cxcr4的表达与runx2水平的正相关关系。5.cxcr4是runx2调控胃癌侵袭转移的重要的下游因子。(1)在runx2上调的同时,我们通过稳定敲低cxcr4或用cxcr4信号通路特异性抑制剂amd3100的方法抑制cxcr4信号通路活化,趋化实验证实胃癌细胞趋化迁移能力显著受损。(2)细胞侵袭试验证实,细胞侵袭能力受cxcr4信号通路抑制而受损。(3)抑制cxcr4信号通路后,在裸鼠胃癌原位移植瘤模型中的结果更具有说服力,胃癌细胞的局部侵袭能力受显著抑制,同时肝脏转移能力显著受损。以上数据证实,cxcr4作为runx2下游一个极为重要的转录因子发挥维持胃癌细胞侵袭转移的作用。总之,通过大样本临床组化检测证实,RUNX2与多种临床病理参数密切相关,是胃癌患者的重要的预示因子。体内外实验证实,RUNX2通过直接转录激活CXCR4进而促进胃癌细胞侵袭转移的发生。通过抑制CXCR4信号通路活性可显著降低胃癌细胞侵袭转移,显著延长小鼠的生存时间。以上结果表明,RUNX2可作为临床肿瘤诊疗的提示因子,为今后靶向RUNX2/CXCR4通路的药物研发提供有价值的试验数据和可行性依据。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2

【参考文献】