EB病毒感染调控长链非编码RNA H19参与胃癌发生发展的研究

发布时间：2019-01-04 23:26

【摘要】：目的(1)筛选胃癌细胞系AGS稳定感染EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)后差异表达的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA),为探讨EBV的致瘤机制提供理论及实验基础。(2)明确EBV阳性和阴性胃癌细胞系以及组织标本中lnc RNA H19的表达水平及差异;探讨EBV感染对胃癌组织中H19启动子区甲基化水平、H19印记状态的影响。方法(1)采用高通量转录组测序(RNA-Seq)技术对AGS细胞系和稳定感染EBV的AGS-EBV细胞系进行转录组测序。(2)对获得的测序数据进行生物信息学分析,包括lnc RNAs表达水平分析、差异表达lnc RNAs的靶基因预测,以及预测靶基因的GO(Gene Ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。(3)采用实时荧光定量q RT-PCR检测EBV阳性胃癌细胞系(GT-38、GT-39、SNU719、AGS-EBV)、EBV阴性胃癌细胞系(MKN-45、SGC7901、HGC-27、AGS)、EBVa GC及EBVn GC组织中lnc RNA H19的表达水平。(4)亚硫酸氢盐基因组测序法(bisulfate genomic sequencing,BGS)及sequenom Mass Array飞行质谱法检测EBV阳性及阴性胃癌细胞系、EBVa GC及EBVn GC组织中H19启动子区甲基化状态;结合检测区434G/T多态性位点,对多态性位点434G/T杂合型标本进行H19启动子区等位基因特异性甲基化分析。(5)依据H19第5外显子区有单一的RsaⅠ多态性酶切位点,采用限制性片段长度多态性(restrictive fragment length polymorphisms,RFLP)结合PCR技术(RFLP-PCR)检测EBVa GC和EBVn GC组织中H19基因的印记状态。结果(1)与AGS细胞系相比,AGS-EBV细胞系中发现879条差异表达的lnc RNAs,包括47条表达上调,832条表达下调;其中24条lnc RNAs在AGS中不表达,243条lnc RNAs在AGS-EBV中不表达。差异表达的lnc RNAs中有肿瘤相关性lnc RNAs,如H19和CCAT1已经证明与多种肿瘤的发生有关。(2)部分差异表达的lnc RNAs预测到靶基因,通过GO富集分析发现预测的靶基因参与了多种生物学过程(biological_process)、细胞成分的组成(cellular_component)及分子功能(molecular_function)。有些lnc RNA的靶基因与凋亡过程(apoptotic process)、细胞周期阻滞(cell cycle arrest)及细胞增殖(cell proliferation)等密切相关。靶基因的KEGG分析结果显示,这些靶基因主要参与氧化磷酸化、代谢途径、内吞作用、唾液腺分泌、胰腺分泌及某些代谢性疾病如Alzheimer症、Huntington病和Parkinson病等途径。(3)4种EBV阳性细胞系lnc RNA H19平均表达水平明显低于4种EBV阴性细胞系(0.04789±0.02991 vs 4.061±0.4192,P0.001);EBVa GC组织中lnc RNA H19的平均表达水平明显低于EBVn GC(0.7024±0.4000 vs 3.646±0.7058,P0.001)。(4)EBV阳性细胞系H19启动子均呈高甲基化状态,而EBV阴性细胞系仅个别Cp G位点呈甲基化状态,EBV阳性细胞系H19启动子Cp G甲基化率明显高于EBV阴性组。BGS法及质谱法检测结果显示21例EGVa GC及17例EBVn GC组织标本中H19启动子平均甲基化率均接近50%,差异无统计学意义(P=0.7791,P=0.729);两组间高甲基化及低甲基化标本组成也无显著性差异(P=0.721)。对EBVa GC及EBVn GC组织中434G/T杂合性标本(各5例)进行了等位基因差异性甲基化分析,结果显示EBVa GC组织中,一条等位基因保持几乎均完全甲基化状态,另一条等位基因亦出现了不同程度的甲基化,其中PL455两条等位基因均几乎完全甲基化;EBVn GC组标本一条等位基因保持几乎均完全甲基化状态,另一条等位基因保持几乎完全未甲基化状态,但Q589两条等位基因均几乎完全未甲基化,EBVa GC组H19启动子甲基化程度高于EBVn GC组。(5)自39例EBVa GC及86例EBVn GC标本中分别筛选出H19第5外显子区RsaⅠ多态性酶切位点杂合型标本24例及28例;有6例EBVa GC组织中(25%,6/24)H19呈双等位基因表达,EBVn GC中亦有6例(21.43%,6/28)H19呈双等位基因表达,两组间H19印记丢失率无统计学差异(P=1.00)。结论(1)EBV稳定感染AGS细胞系可导致宿主细胞lnc RNAs表达水平发生改变,以表达下调的lnc RNAs居多。部分差异表达的lnc RNA与肿瘤的发生密切相关。(2)差异表达的lnc RNAs参与了多种细胞生物学活动,提示EBV可以通过lnc RNA进一步作用于其靶基因,进而更广泛地影响宿主基因的转录调控,参与EBV相关肿瘤的发生发展。(3)EBV感染对胃癌细胞中lnc RNA H19的表达具有显著影响,EBV可能通过调控lnc RNA H19的表达参与EBVa GC的发生与发展。(4)EBV阳性细胞系H19启动子区甲基化水平明显高于EBV阴性细胞系,启动子区甲基化程度与lnc RNA H19的表达水平密切相关,是调控H19表达的重要因素。但EBVa GC和EBVn GC组织中H19启动子区甲基化程度无显著性差异,提示体内除启动子甲基化外,尚有其它因素参与H19转录表达的调控。(5)胃癌组织中存在一定比例的H19印记丢失,这可能是胃癌组织中H19表达水平增高的原因之一,EBV感染对胃癌组织中H19基因的印记丢失无明显影响。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

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本文编号：2400943