PD-1和TIM-3在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及其对细胞增殖与凋亡的影响

发布时间：2019-01-24 20:07

【摘要】：背景弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最常见的类型,在欧美国家几乎占所有NHL的1/3,在亚洲国家占NHL大于40%[1]。这类淋巴瘤占以前临床上的“侵袭性”或“中高度恶性”淋巴瘤的大多数病例。DLBCL在形态学、免疫表型、遗传学和临床表现极具异质性[2],其生长迅速,但是一般对治疗反应较好,5年生存率可达75-80%,经过CHOP样方案治疗,3/4的患者在治疗后没有症状,近50%患者可以治愈,但是仍有30%-40%的DLBCL出现初始原发耐药、疾病残留或完全缓解后复发,尽管高剂量解救性化疗和造血干细胞移植可提高复发/难治患者的有效率,但绝大多数患者最终复发。近几年,针对与肿瘤发生有关的细胞信号通路、原癌基因和抑癌基因、细胞因子及受体的分子靶向药物治疗已初显成效[3-6]。因此,进一步研究本疾病的发病机理和新的治疗方法尤为重要。近年来,随着肿瘤免疫学研究的不断深入,研究发现在恶性肿瘤发生、发展、转移、复发的各个阶段,肿瘤与机体免疫系统存在着复杂多变的关系。许多肿瘤相关抗原被确认为自身免疫系统的成分[7],因此肿瘤免疫在某种程度上可以说是自身免疫,而自身免疫耐受可能阻碍肿瘤免疫过程[8]。在自身免疫耐受的诸多机制中,目前的研究发现调节性T细胞在自身免疫耐受中扮演着重要的角色,它们的缺陷和功能失调将直接引起自身免疫性疾病[9]。T细胞的活化是由两种活化信号共同参与的,第一信号首先由T细胞受体(TCR)识别抗原,然后经CD3分子将刺激信号传导至细胞内[10]。第二信号是由抗原提成细胞或靶细胞表面的协同刺激分子与T细胞表面相应的协同刺激分子相互作用而产生的。而协同刺激分子是受共刺激因子和共抑制因子调节的,调节着T细胞激活的强度和免疫应答的幅度。但是,T细胞在慢性病毒感染或长时间接触肿瘤抗原时就会异常表达共抑制因子,其效应功能就会受到抑制而不能发挥正常作用。因此,研究这些协同刺激信号有助于探索新的免疫治疗策略。PD-1和TIM-3是协调刺激分子家族重要成员,均属于负性调控因子,不仅参与调节自身免疫过程,而且在肿瘤免疫中也起着重要作用。PD-1(程序性死亡受体-1,programmed death 1)为CD28超家族成员,主要表达于T淋巴细胞、B淋巴细胞、骨髓细胞上,可促进T淋巴细胞的活化并上调效应期的淋巴细胞功能。有研究发现,敲除小鼠PD-1基因可导致多种自身免疫性疾病的发生,提示PD-1很可能是一种重要的免疫抑制分子,在免疫耐受及肿瘤的免疫逃逸中发挥着重要的作用。因此,以PD-1为靶点研究对抗肿瘤、抗自身免疫性疾病等均有重要的意义[11,12]。TIM-3 (T lymphocyte immune globulin mucin-3)是T淋巴细胞免疫球蛋白粘蛋白(TIM)基因家族成员,高表达于辅助性T细胞1(Thl)和细胞毒性T细胞(CTL)上,并产生抑制性信号从而导致Thl和CTL细胞的凋亡[13,14]。TIM-3引起Thl细胞程序性死亡的原因是TIM-3能与其配体半乳糖凝集素-9(Galectin-9,Gal-9)特异性结合,提供负性共刺激信号所致。因此,TIM-3可下调Thl细胞免疫反应,被认为是一种负性免疫调控因子。研究显示,TIM-3对除Thl和CTL细胞外的其他类型免疫细胞也具有调节作用,在一些自身免疫性疾病发生、发展中发挥着重要的作用,其免疫调节功能成为研究的热点[15]。也有研究表明[16-18],PD-1或／和TIM-3在实体瘤组织T淋巴细胞高表达,通过抗体阻断PD-1和／或TIM-3信号通路能够使肿瘤特异性T细胞的抗肿瘤活性得到恢复；封闭PD-1或／和TIM-3基因可以抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞的凋亡。因此,PD-1和TIM-3在肿瘤的发生、发展、增殖及凋亡中可能也起着重要作用。因此,本研究首先检测了DLBCL患者外周血CD3+T细胞上PD-1和TIM-3的表达水平,分析其表达与临床指标、化疗疗效的关系,对比化疗前后PD-1和TIM-3的变化,希望该研究能够为将来DLBCL发病机理研究、进一步判断预后提供理论依据。本研究还通过慢病毒介导,分别靶向沉默人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株OCI-Ly19中的PD-1基因和TIM-3基因,初步探讨沉默PD-1基因、TIM-3基因对人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株OCI-Ly19的增殖、克隆、周期及凋亡的生物学行为的影响,进而为DLBCL的治疗提供新的靶点和思路。目的1.探讨PD-1和TIM-3在DLBCL患者CD3+T细胞的表达水平。2.分析PD-1和TIM-3的表达与临床指标的关系。3.对比DLBCL患者化疗前后PD-1和TIM-3的变化。4.分析PD-1和TIM-3的表达与化疗疗效的关系。5.研究沉默PD-1基因、TIM-3基因对OCI-Ly19细胞的增殖、细胞周期分布的影响。6.探讨沉默PD-1基因、TIM-3基因对OCI-Ly19细胞的克隆形成及凋亡的影响。方法1.46例初诊DLBCL患者和30例健康对照者作为本研究的对象。2.采用流式细胞仪检测化疗前后患者与对照者PD-1和TIM-3的表达率。3.分别构建PD-1、TIM-3慢病毒载体,用293T包装浓缩生成病毒液,感染OCI-Ly19细胞,即PD-1基因沉默组(Lv-PD-1)、TIM-3基因沉默组(Lv-TIM-3)作为实验组,另分别设阴性对照组(Lv-Con)和空白对照组(Con)。罩4.应用实时定量PCR和Western-blot检测慢病毒感染后PD-1、TIM-3基因和蛋白的表达。5.采用CCK-8和流式细胞术分别检测OCI-Ly19细胞增殖、细胞周期及凋亡情况。6.所有实验重复至少3次,应用GraphPad Prism 5统计软件进行数据分析,P0.05有统计学差异。结果1.在DLBCL患者CD3+T细胞中PD-1和TIM-3的表达率都较正常对照者明显升高。2.PD-1和TIM-3在Ⅰ/Ⅱ期DLBCL患者中无明显变化,但在Ⅲ/Ⅳ期患者中的表达显著增加。3. DLBCL患者中有B症状者、IPI评分2分者、LDH及Ki-67水平高者PD-1和TIM-3的表达水平亦升高。4.PD-1和TIM-3的表达水平在化疗前、标准化疗2个疗程后、4个疗程后逐渐下降。5.低表达PD-1和TIM-3患者的治疗有效率高于高表达者。6.PD-1基因沉默组OCI-Ly19细胞PD-1mRNA及PD-1蛋白含量明显下降；TIM-3基因沉默组OCI-Ly19细胞TIM-3mRNA及TIM-3蛋白含量也明显下降。7.与阴性对照组和空白对照组相比,沉默PD-1、TIM-3基因后OCI-Ly19细胞的增殖能力明显下降,G0/G1期的细胞比例升高,S期细胞比例下降。8.沉默PD-1、TIM-3基因后OCI-Ly19细胞克隆形成能力与阴性对照组和空白对照组相比下降,凋亡率升高。结论1. DLBCL患者CD3+T细胞PD-1和TIM-3的水平升高,其表达与DLBCL的分期、预后及增殖均有关,在DLBCL的发展中起重要作用。2.PD-1和TIM-3的表达水平随化疗进行逐渐下调,且与化疗有效率有关,可作为DLBCL患者化疗敏感指标及预后因素。3.沉默PD-1基因、TIM-3基因可有效抑制OCI-Ly19细胞的增殖,使OCI-Ly19细胞克隆能力下降。4.沉默PD-1基因、TIM-3基因可促进OCI-Ly19细胞的凋亡。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.1

【参考文献】