发生上皮间质化的循环肿瘤干细胞在肺癌增殖、耐药及骨转移过程中相关作用的研究

发布时间：2019-01-27 17:47

【摘要】：研究背景与目的:肺癌是目前临床上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,每年因肺癌死亡的患者约占所有肿瘤死亡患者的20%。根据病理类型和临床表现,肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两大类,其中非小细胞肺癌约占肺癌患者总数的80~85%。肺癌转移能力很强,据统计,约65%的肺癌患者在初次就诊时就已经伴有远处转移。骨骼系统是肺癌转移最常见的受累部位之一,约半数的骨转移灶发生在脊椎,其次是肋骨,约占所有骨转移的27%,一般均为溶骨性破坏。这些患者不得不忍受因骨破坏所造成的剧烈疼痛和病理性骨折,脊柱转移病灶还有可能造成患者出现脊髓压迫甚至瘫痪等并发症。目前针对肺癌骨转移的治疗手段通常是使用放疗或双磷酸盐类药物延缓骨破坏的进程,少部分经临床评估预后较好的患者可手术切除病灶。尽管目前临床医师对肺癌患者采取了系统性综合治疗的方法,肺癌骨转移的患者预后仍然极差,出现骨转移的非小细胞肺癌患者中位生存期只有六个月,5年生存率不超过5%。因此,对伴有骨转移的肺癌患者的治疗是临床工作中一个颇为棘手的问题。目前,人们对肿瘤在人体内转移的基本过程已经有了较为清楚的认识。肿瘤细胞在转移过程中通常需要经历以下四个关键步骤:1、脱离肿瘤原发病灶2、侵犯相邻正常组织或穿透基底膜3、经由毛细血管或淋巴管进入血液循环4、保持细胞活性并离开血液循环进入靶器官5、自我增殖并与微环境相互作用,最终形成转移灶。对肿瘤转移相关分子机制的研究是目前国内外研究热点之一,但由于肿瘤转移过程复杂,且每一步都涉及多条信号通路,进展较为缓慢。细胞由上皮细胞形态向间质细胞形态转变的过程称为上皮—间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),由于发生EMT的细胞与周围细胞间粘附性降低,运动能力增强,便于肿瘤细胞从原发灶中脱离,EMT被认为是肿瘤细胞转移过程中关键的始动因素。虽然无限生长是肿瘤的标志性特征之一,但人们发现并不是所有的肿瘤细胞都具有无限增殖的的能力。研究表明,在实体肿瘤中存在着少数具有高度增殖能力的肿瘤细胞。只需少量这类细胞便能在免疫缺陷动物中形成一个新的肿瘤,而要达到同样效果则需要至少100倍数量级的原代肿瘤细胞。人们把这种具有类似正常干细胞的增殖潜能的肿瘤细胞称为肿瘤干细胞。目前研究表明,EMT跟肿瘤干细胞间存在着紧密联系,如果在上皮型肿瘤细胞中过表达SNAI1和TWIST1等EMT管家基因,则肿瘤细胞在发生EMT的同时,也表现出了干细胞的某些特性。随着抗体芯片技术的成熟,人们能从几乎所有实体肿瘤患者的外周血中检测到肿瘤细胞,这种存在于血液循环中肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cells CTCs)。CTCs的数量与临床肿瘤患者的预后之间存在着一定联系。但CTCs的数量与临床转移灶之间却没有明显的相关联系。进一步分析结果表明,CTCs细胞中存在着多种细胞亚型,其中间质型的CTCs只占CTCs的一小部分。通过综合考虑EMT、CTCs和肿瘤干细胞的定义与特点,我们推测,只有发生了上皮间质化的CTCs才有可能形成新的转移灶。因此,分离并检测分析发生了EMT的CTCs可以使我们进一步的了解肺癌骨转移的细胞和分子机制。并为针对肿瘤转移的靶向药物的研制提供潜在的研究方向和治疗靶点。研究内容与方法:首先,我们选取长征医院胸外科进行手术的肺癌患者肺癌原发灶样本和骨转移灶样本,并利用患者肺癌瘤旁正常肺组织作为对照,利用免疫组化的方法检测样本中常见上皮细胞标记CDH1、EPCAM和间质细胞标志物VIM的表达水平。随后我们通过使用前期研究中得到的具有一定亲骨特性的人肺腺癌细胞系PC-9H对BCLB/c裸鼠进行肺原位注射荷瘤。通过流式细胞分选的方法从BCLB/c裸鼠外周血中分离发生了EMT的肺癌细胞PC-9EMT。并动态观察肿瘤的生长和转移情况。在得到PC-9EMT细胞后,我们通过MTS、蛋白免疫印迹试验、细胞免疫荧光实验、Transwell实验、克隆形成实验、成球细胞培养实验、细胞周期和凋亡检测实验和鼠巨噬细胞向破骨细胞诱导分化等实验比较PC-9EMT、PC-9H和原始PC-9细胞株之间的差异,观察并验证PC-9EMT细胞的生物学特性。最后我们通过对PC-9EMT、PC-9H和原始PC-9细胞进行了真核转录组测序并对测序结果中感兴趣的关键基因进行了实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)验证,最后再使用公共数据库对差异基因进行了生物信息学分析,初步探究了肺癌骨转移的分子生物学调控机制。研究结果与结论:通过上述实验,我们在此次研究中得到了下列结果。1、建立了可重复检测外周血中CTCs的肺原位移植瘤BCLB/c裸鼠模型。2、在BCLB/c裸鼠肺原位移植瘤外周血中分离出发生了EMT的肺癌细胞PC-9EMT并成功进行了体外培养。3、通过细胞学实验证明PC-9EMT细胞同时具有间质细胞和干细胞的特征。4、通过对PC-9EMT细胞进行真核转录组测序,发现FN1、SNAI1、TWIST1、COL1A1、COL6A1、JUP、OCLN、L1CAM、KRT17、S100A4、KPTN、MMP9、DLC1和EMP3基因可能在肺癌骨转移过程中发挥着重要的调控作用。通过上述研究,我们建立了一个简便易行的人肺腺癌BCLB/c裸鼠肺原位移植瘤模型,通过这个动物模型我们可以动态的观察肿瘤细胞在BCLB/c裸鼠体内的生长和转移情况,并且可以通过流式细胞技术从少量外周血中检测和分离循环肿瘤细胞。为研究肺癌转移提供了新的研究手段和方法。随后我们通过这个新的动物模型获得了发生上皮间质化的循环肿瘤细胞PC-9EMT,并且通过体外实验证明PC-9EMT具有较高的增殖、迁移能力,且对肺癌常用的铂类化疗药物具有耐受性。PC-9EMT细胞在体外共培养条件下还能诱导单核细胞向破骨细胞分化。这些结果表明,发生EMT的CTCs具有肿瘤干细胞的特征,在肺癌的耐药、复发和骨转移过程中扮演着重要的角色。最后,我们通过进一步分析PC-9EMT细胞的基因表达情况,挑选出了可能的关键基因,为后续肺癌骨转移分子机制的深入研究提供了初步的理论和实验依据。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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