Fat4低表达通过诱导Yap核转位增强胃癌细胞的增殖与转移并导致胃癌患者预后不良

发布时间：2019-02-13 10:44

【摘要】：背景胃癌是我国发病率和死亡率排名第三的恶性肿瘤,其发生发展与信号通路的失调密切相关。Hippo-Yap信号通路与消化系统的器官发育、组织修复有关,而且对胃癌细胞的生存、转移等具有抑制作用,其效应元件Yap是治疗胃癌的重要靶点。Fat4是Fat钙黏蛋白家族成员,作为一种单跨膜蛋白受体,与哺乳动物的细胞分化、组织发育有关。Fat4可以作为Hippo-Yap通路的上游信号分子转导细胞间的信号,其低表达会造成哺乳动物肾脏、神经管以及内耳等的发育缺陷。有研究发现,Fat4还能够作为肿瘤抑制因子抑制胃癌细胞的增殖与迁移,但是Fat4在许多肿瘤包括胃癌中都存在基因突变导致的蛋白缺失。因此Fat4的缺失有可能与胃癌细胞的增殖、转移能力的改变以及胃癌患者预后有关,并且可能与其参与Hippo-Yap信号通路的调节有关,但是其相关性及发生机制尚未阐明。目的研究Fat4的低表达与胃癌细胞的增殖、迁移、耐药性等生物学行为的相关性;探讨Fat4的表达异常对胃癌细胞中Hippo-Yap信号通路的调节机制;明确Fat4的表达与胃癌组织的临床病理学特征及患者预后之间的相关性。方法1.1)通过基因干扰技术(Fat4-shRNA)敲低Fat4在胃癌细胞中的表达,应用Western blotting实验检测Fat4低表达对Yap、p-Yap、LATS、p-LATS、CyclinD1及c-Myc蛋白表达的影响;2)采用MTT、平板克隆及裸鼠移植瘤实验检测Fat4敲低对胃癌细胞增值能力的影响;3)通过流式细胞术分析Fat4敲低对胃癌细胞周期的影响：4)采用Transwell实验观察Fat4敲低对胃癌细胞迁移能力的影响。2.1)通过Western blotting实验检测Fat4敲低的胃癌细胞(shFat4细胞)的胞浆蛋白与胞核蛋白中的Yap、p-Yap,β-catenin的蛋白表达水平,以及Yap敲低的胃癌细胞(shYap细胞)中胞浆p-Yap与β-catenin蛋白的表达水平;2)通过qRT-PCR实验检测Fat4敲低及Yap敲低的胃癌细胞中Fat4、Yap、 P-catenin的mRNA相对表达水平;3)将Fat4全长基因克隆至胃癌细胞使其过表达(Fat4细胞),或克隆至Fat4细胞(shFat4+Fat4细胞)或shCtrl细胞(shCtrl+Fat4细胞)中,并通过Western blotting实验检测Fat4、p-Yap Yap CyclinD1及MMP-7的蛋白表达;同时应用流式细胞术分析上述胃癌细胞的细胞周期;4)通过MTT法检测Fat4敲低的胃癌细胞在接受5-FU、顺铂、奥沙利铂和紫杉醇处理后的存活率。3.1)收集122例接受过胃癌D2根治术治疗的患者的蜡块组织及临床病理资料：2)用免疫组织化学染色检测Fat4和Yap蛋白在122例胃癌组织及85例正常胃黏膜组织的表达情况;3)通过Pearson X2检验探讨Fat4表达量与胃癌临床病理特征之间的相关性;4)采用Kaplan-Meier法及Cox回归风险比例模型分析研究Fat4的表达量与胃癌患者累积生存率的相关性。结果1.1) shFat4细胞相对于对照组胃癌细胞(shCtrl细胞),其Fat4蛋白表达水平显著降低,同时p-Yap及p-LATS的蛋白表达也降低,但是Yap及LATS的蛋白表达没有改变;2) p-Yap与Yap蛋白水平的比值(p-Yap/Yap)和p-LATS与LATS蛋白水平的比值(p-LATS/LATS)在shFat4胃癌细胞中显著低于shCtrl细胞：3) shFat4细胞的细胞相对于shCtrl细胞,其细胞活性升高(P0.05),克隆形成数目增加(P0.05),裸鼠皮下瘤的体积增大、生长速度增快(P0.05)：4) shFat4细胞的细胞相对于shCtrl细胞,其在G1期的比例下降(50.69% vs.30%,P0.05),在G2/M期的比例升高(49.31% vs.70%,P0.05),而且细胞周期蛋白CyclinDl及c-Myc的蛋白表达显著增加;5) Transwell小室中Fat4敲低的胃癌细胞吸光度值高于shCtrl细胞(1.57 vs.0.65,P0.05); Fat4敲低的胃癌细胞相对于对照组胃癌细胞,其迁移相关蛋白MMP-7、Cyr61增加而E-cadherin降低。2.1)Fat4敲低的胃癌细胞相对于shCtrl细胞中,胞浆p-Yap蛋白水平降低,胞核Yap蛋白水平升高,但是胞浆Yap蛋白水平不变;2)相对于shCtrl细胞,shFat4细胞或shYap细胞的胞浆蛋白中的p-Yap表达水平降低但P-catenin表达水平升高;shFat4细胞或shYap细胞中的P-catenin mRNA相对表达量与对照组没有差异;3) shFat4细胞相对于shCtrl细胞,其Fat4、p-Yap蛋白表达降低,CyclinD1及MMP-7蛋白表达升高,但是全长Fat4过表达转染使上述蛋白表达水平出现逆转;shFat4细胞相对于shCtrl细胞,其S/G2/M期的胃癌细胞比例增加,但是可以被全长Fat4过表达转染所逆转。4)胃癌细胞接受5-FU、顺铂、奥沙利铂和紫杉醇处理后,shFat4细胞的细胞生存率高于shCtrl细胞。3.1)胃癌组织中Fat4蛋白的阴性染色显著高于邻近非胃癌组织(69% vs.33%,P0.05); Fat4在胃癌组织的阳性表达与胞核Yap的表达呈负相关(x2=24.0484,P=0.0000);2)Fat4的阴性染色与胃癌的淋巴管侵犯(P=0.0011)、肿瘤浸润深度(P=0.00166)、淋巴结转移(P=0.0007)呈正相关：3)Fat4的阴性染色与胃癌患者的累积生存率呈负相关(P=0.004)。结论1.Fat4蛋白低表达会导致胃癌细胞内p-Yap蛋白减少,并使胃癌细胞的增殖和细胞周期进程加快,以及迁移能力增强;2.Fat4蛋白低表达通过促进Yap及β-catenin蛋白的核转位增加而发挥增强胃癌细胞的增殖、迁移及化疗耐药的能力。3.Fat4蛋白低表达与胃癌的浸润深度、淋巴转移正相关,与胃癌患者的预后呈负相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

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本文编号：2421472