蛋白核心岩藻糖基化在原发性肝癌中的临床意义及应用研究

发布时间：2019-02-14 14:33

【摘要】：原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),作为肝脏恶性肿瘤的一种,是临床上原发性肝癌的主要形式,为世界五大常见恶性肿瘤之一,每年世界范围内近25万人死于肝癌,在全球肿瘤致死率中高居第三位。中国是肝癌大国,全球50%以上的新发和死亡肝癌患者发生在中国。流行病学及实验研究资料表明,乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、黄曲霉素、酒精等是我国肝癌发病的主要病因。研究显示,大部分肝癌患者都会经历从肝炎到肝硬化,最后进展到肝细胞癌的过程。目前,肝癌的五年生存率仍不到10%。由于肝癌起病隐匿,发病时多数患者已处于肝癌晚期,失去了治疗的机会。因此,肝癌的早期诊断尤为重要。目前,组织活检和病理检查是肝癌诊断的"金标准”,然而由于其有创性,临床应用有限。血清甲胎蛋白(AFP)自上世纪60年代发现后逐渐应用于临床,作为迄今为止临床诊断HCC的首选指标,AFP的诊断灵敏度只有约60%,在一些非肝癌疾病如肝脏良性疾病、炎症反应时也可见其升高,其诊断效果同样不能让人满意。肝癌的起病及进展由多个蛋白分子参与,是一个复杂的生物学过程,而研究表明血中过半的蛋白分子都存在糖基化现象。AFP-L3,即核心岩藻糖基化的甲胎蛋白早在2005年就已被美国食品药品管理局(FDA)采纳应用于临床。研究发生特定糖基化改变的蛋白与肝脏疾病发生发展的关系对于肝病的诊治及预后都具有十分重要的作用。与此同时,近年来的定量蛋白质组学也取得了巨大的技术进步,以质谱为基础的定量蛋白质组学越来越多地被应用于临床。本课题将围绕血清中发生核心岩藻糖基化改变的蛋白,从两个方面探讨核心岩藻糖基化蛋白在原发性肝细胞癌中的临床意义。第一部分:凝集素亲和富集寻找血清中的原发性肝癌差异糖蛋白本研究对收集的健康对照(Healthy control,HC)、肝硬化(Liver cirrhosis,LC)及原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)患者的血清差异核心岩藻糖基化蛋白进行筛选。LCA可与核心岩藻糖基化聚糖发生特异性结合亲和富集HC、LC及HCC人群血清蛋白,利用质谱技术寻找三组间差异蛋白。通过先初筛再验证的策略,旨在综合不同质谱技术差异,筛选核心岩藻糖基化差异蛋白。利用orbitrap质谱分析检测并进行三组样本间差异蛋白分析;随后扩大样本,采用两种不同的质谱方法对初筛结果进行验证,并对两种不同质谱方法差异展开分析讨论。结果:综合初筛及两种不同质谱方法的验证结果,LC与HC组间的差异蛋白为:血清淀粉样组分P(Serum amyloid p-component),孕区蛋白(Pregnancy zone protein),触珠蛋白相关蛋白(Haptoglobin-related protein),核心岩藻糖基化的三种蛋白HC组水平显著高于LC组;HCC与HC组间的差异蛋白为性激素结合蛋白(Sex hormone binding protein)、多聚免疫球蛋白受体(Polymeric immunoglobulin receptor),核心岩藻糖基化的两种蛋白在HCC组水平显著高于HC组;HCC与LC组间的差异蛋白包括血清淀粉样组分P(Serum amyloid p-component),触珠蛋白(Haptoglobin),甲状腺素运载蛋白(Transthyretin)及载脂蛋白L1(Apolipoprotein L1),四种核心岩藻糖基化蛋白在HCC组水平均显著高于LC组。结论:本研究利用糖链与凝集素的结合特性,在亲和纯化的基础上,利用高分辨率质谱技术从糖基化层面寻找肝癌、肝硬化的差异蛋白,本实验得到的差异糖基化蛋白中核心岩藻糖基化的血清淀粉样组分P、孕区蛋白、触珠蛋白相关蛋白可能具有鉴别诊断HC与LC的潜力;核心岩藻糖基化的性激素结合蛋白、多聚免疫球蛋白受体或可用于HCC与HC的鉴别诊断;核心岩藻糖基化的血清淀粉样组分P、触珠蛋白、甲状腺素运载蛋白及载脂蛋白L1或具有鉴别诊断HCC与LC的潜在价值。这些发现均有待后续研究验证。第二部分:四种特定糖蛋白对HCC诊断及手术疗效判断意义分析通过阅读文献及分析临床检测的可及性,本研究对铁蛋白(Ferritin,Fer)、IgG、α2-M及转铁蛋白(Transferrin,Trf)这四种特定蛋白及其核心岩藻糖基化组分(以下简称为异质体)在原发性细胞癌中的诊断意义及其在肝细胞癌根治切除术前后的随访价值进行了初步探讨。结果显示Fer异质体%、α2-M、α2-M异质体%及Trf在HCC组与非HCC组间存在差异,其中α2-M、α2-M异质体%HCC组水平高于非HCC组。四种特定蛋白与AFP及AFP-L3%相关性比较中,IgG异质体%、Trf异质体%均与AFP-L3%呈正相关。四种特定蛋白及其异质体%对HCC的诊断阳性率均不及目前临床广泛应用的AFP及AFP-L3%;四种特定蛋白中,只有α2-M及其异质体%对HCC诊断的AUC0.6(p0.05)。联合检测AFP、α2-M及α2-M异质体%可显著提高对HCC的诊断价值,尤其是诊断灵敏度从单独检测AFP时的不足85%提升到90%。对四种特定蛋白与HCC肿瘤大小的相关研究显示,HCC肿瘤直径与Trf-L3%正相关。在30例行肝癌根治性切除术的标本中,Fer异质体、Fer异质体%、IgG、IgG异质体、Trf异质体在术前术后有显著性差异,其中Fer异质体、Fer异质体%术后水平较术前降低。在HCC根治性切除术前术后AFP显著下降组中,术后较术前显著降低的指标有Fer异质体、Fer异质体%及IgG异质体%;在术前AFP阴性的术前术后配对标本中,α2-M异质体及α2-M异质体%水平在术后较术前显著降低。结论:四种临床常用的特定蛋白Fer、IgG、α2-M、Trf中,α2-M及其异质体%在HCC的早期辅助诊断及肝细胞癌根治性切除术效果的随访上具有重要潜在应用价值。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【参考文献】