基于提高对肝肿瘤治疗效果的载萝卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅纳米脂质体的体内外研究

发布时间：2019-02-19 21:58

【摘要】：肝脏肿瘤是全球第五大常见癌症和引起死亡的第三大疾病。肝脏肿瘤在我国发病率越来越高,化疗中的多药耐药导致的高复发率使患者难以长期生存,对于不能手术治疗的中晚期患者,目前还没有有效的治疗手段。近年来大量事实证明肝肿瘤是由肝肿瘤干细胞(LCSC)所引发,肝肿瘤干细胞对常规化疗药物的耐药性和放射疗法不敏感,治疗后残余的肿瘤干细胞会分化增殖,因此,肝肿瘤干细胞在肝肿瘤治疗和复发中起着关键性作用。要想达到根治肝肿瘤的的目的,需要同时彻底清除肝肿瘤细胞和肝肿瘤干细胞。萝卜硫素(1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷,英文名Sulforaphane,SFN),在西兰花、甘蓝、萝卜等十字花科类植物中含量较高,能够抑制Ⅰ相P450细胞色素酶,诱导Ⅱ相金属还原酶,导致细胞周期停滞和凋亡,可选择性作用于多种肿瘤干细胞。甲苯磺酸索拉菲尼(4-{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)酰脲]苯氧基}吡啶-2-甲酰胺对甲苯磺酸盐,英文名Sorafenib tosylate,ST)是一种多靶点的口服抑制剂,能抑制VEGFR、PDGFR、KIT等受体酪氨酸激酶活性,还可以抑制RAF激酶活性,既可作用于肿瘤细胞又可作用于肿瘤血管,能够显著改善晚期肝肿瘤患者的生存状态,是目前临床上肝肿瘤治疗的一线药物。为了达到同时杀伤肝肿瘤普通细胞和肝肿瘤干细胞的目的,本课题设计了载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米脂质体(SFN/MSN/LIPs)和载甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅纳米脂质体(ST/MSN/LIPs)。借助高效液相色谱技术建立了萝卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼的含量测定方法。萝卜硫素的线性方程为:A=40,238,415C+57,864(R2=0.9993),线性范围为:2.52～161.50μg?mL-1。甲苯磺酸索拉菲尼的特异性良好,线性方程为:A=88885C+45916(R2=0.999),线性范围为:1.96～125.38μg?mL-1。经考察,萝卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼的体外HPLC测定方法的特异性、线性相关性、准确度、精密度均符合体外测定要求,可用于萝卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼的体外含量测定,为萝卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼在药剂学实验中包封率、载药量以及体外释放度的测定建立了良好的基础。在已有文献研究和课题组前期工作的基础上,制备了介孔二氧化硅纳米粒。通过降低分散介质的pH,减少了纳米粒子的聚集,再借助超声破碎仪或微射流超高压纳米均质机将纳米粒分散细化,提高了体系的稳定性,使纳米粒子的氨基化更均匀。纳米粒经氨基化后,在中性条件下就能保持很好的分散性,为下一步制备ph响应型的载体系统奠定基础。采用激光纳米粒度测定仪,扫描电子显微镜(sem),透射电子显微镜(tem)对载体介孔结构、分散状况、表面形态、粒径分布、zeta电位等性质进行表征。采用氮气吸附-脱附法对载体的比表面积、孔径和孔容积进行了考察。结果表明:(1)采用表面活性剂模板法(surfactanttemplatemethod)制备的介孔二氧化硅纳米粒,粒径在100nm左右,粒径均一性好,呈球形,bet多点比表面积为709.24m2?g-1,bjh吸附累积总孔体积为0.71cm3?g-1,bjh吸附平均孔径为4.69nm,且具有较窄的孔径分布。(2)对msn表面用aeptms进行氨基化修饰,制备了氨基化的msn(msn-nh2),在不改变介孔结构的前提下,改善了msn的分散性,(3)将载药的msn包裹于由二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)和二油酰磷脂酰胆碱(dopc)及胆固醇(cholesterol)共同组成的ph敏感脂质体中,利用了ph敏感脂质体的特性,在中性条件下,羧基质子化,磷脂材料的立体形状呈倒置圆锥体,(即亲水段大而亲油端小),弥补了dope的立体缺陷(立体结构呈圆锥状,但亲水端小而亲油端大),形成稳定的脂质双分子层膜,在酸性条件下,羧基质子化,亲水端体积变小,失去对dope的补缺作用,类生物膜结构变得不稳定,最终与生物膜融合而释放药物。从而实现对肿瘤的靶向治疗作用。(4)通过采用透析管方式考察载体对药物在不同ph条件下的释放行为,来推测载体在体内可能出现的释放情况。结果表明,药物的释放具ph依赖性,在ph=7.4(生理条件)下,药物释放相对较慢,而在ph=5.0(肿瘤内环境)条件下,释放速度加快,且趋于完全释放,这有助于发挥药物对肿瘤细胞和肿瘤干细胞的杀伤作用。在课题组已有研究工作的基础上,本文采用无血清悬浮培养技术,成功筛选分离出hepg2微球体,作为研究肝肿瘤干细胞的模型。在此基础上,考察了萝卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼对肝肿瘤细胞hepg2细胞系和肝肿瘤干细胞hepg2微球体的杀伤作用,并进一步考察了对肝肿瘤干细胞hepg2细胞系和hepg2微球体的联合杀伤作用。结果表明:(1)对hepg2细胞系,当萝卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼摩尔比例为1:5、1:10、1:20时,联合作用指数ci值小于1,均表现为协同作用;两药比例为20:1、10:1、5:1、1:1时,在低浓度时联合作用指数ci值小于1,表现为协同作用,而在高浓度时联合作用指数ci值大于1,表现为拮抗作用。(2)对hepg2微球体,当萝卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼摩尔比例为5:1、1:1、10:1、20:1时,在低浓度时联合作用指数ci值小于1,表现为协同作用,而在高浓度时联合作用指数ci值大于1,表现为拮抗作用;当两药比例为1:5、1:10、1:20时,联合作用指数ci均小于1,表现为协同作用。由于sfn毒性作用较低,最终优选出二者的给药比例为1:5(在此比例下对hepg2细胞系和hepg2-ms均具有协同作用)。为处方设计和后续体内实验提供了依据。借助流式细胞仪和激光共聚焦显微镜考察了肝肿瘤细胞对介孔二氧化硅纳米脂质体的摄取。从流式细胞仪测定结果可以看出,空白载体(msn/lips)组的荧光强度较未处理组细胞无显著性差异,萝卜硫素和甲苯磺酸索拉菲尼(sfn+st)联用组和sfn/msn/lips+st/msn/lips组的荧光值显著高于未处理组,sfn/msn/lips+st/msn/lips组的荧光值又显著高于sfn+st组,说明sfn/msn/lips+st/msn/lips组中进入hepg2细胞的药物量高于sfn+st组,说明载体对肝癌hepg2细胞和hepg2微球体均具有一定靶向性。激光共聚焦显微镜直观观察肝肿瘤细胞与介孔二氧化硅纳米脂质体的作用过程。结果表明,在肿瘤细胞内吞的作用下,载体可以进入细胞内部并完成药物释放,实现细胞靶向给药。介孔二氧化硅纳米脂质体对肝肿瘤细胞具有一定的靶向性。实验还考察了载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米脂质体(sfn/msn/lips)和载甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅纳米脂质体(st/msn/lips)以优选比例给药,对肝肿瘤hepg2细胞和hepg2微球体的杀伤作用。结果显示,与二者游离药物以优选比例给药相比,作用有显著性差异(p0.05)。说明纳米载体对肝肿瘤hepg2细胞和hepg2微球体具有一定靶向性。建立了人肝肿瘤hepg2细胞裸鼠移植模型,在此基础上,以裸鼠肿瘤体积变化曲线、体重改变、肿瘤的重量差异、肿瘤抑制率、离体肿瘤细胞再培养微球体成球率等为指标考察了载药介孔二氧化硅纳米脂质体在动物体内的抗肿瘤效果。体内抗肿瘤活性评价结果表明,空白药物载体msn/lips组与生理盐水组相比,无显著性差异(p0.05);体重变化率均无体重下降现象,说明msn/lips及载药msn/lips用于治疗肝肿瘤无明显的毒副作用,可用于肝肿瘤的治疗。甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅纳米脂质体组(st/msn/lips)及载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米脂质和载甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅纳米脂质体联用组(sfn/msn/lips+st/msn/lips),与其他组相比,具有显著性差异(p0.05),说明药物联用优于药物单独使用,更优于两种游离药物的联用和单独使用,提示载荷药物的介孔二氧化硅纳米脂质体联用通过高载药量、pH敏感释放和纳米尺度的EPR效应可同时提高对体内肿瘤细胞和肿瘤干细胞的杀伤作用。裸鼠体内抗肝癌干细胞活性研究的结果表明,药物处理组与生理盐水组相比,微球体的直径偏小,微球体形成率有统计学差异(p0.05),说明SFN和ST对肝肿瘤干细胞均有作用;载体联用组与游离药物联用组相比,微球体形成率有统计学差异(p0.05),说明SFN和ST经MSN/LIPs包载后,可以同时作用于肝肿瘤细胞和肝肿瘤干细胞,增强了体内抗肿瘤活性。综上所述,本课题研究设计的载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米脂质体和载甲苯磺酸索拉菲尼介孔二氧化硅纳米脂质体载体系统与其它纳米给药系统相比可以提高对两种药物载药量,提高药物的稳定性和分散性。SFN/MSN/LIPs与ST/MSN/LIPs联用,可以同时作用于肝肿瘤细胞和肝肿瘤干细胞,其抗肝肿瘤活性优于两种药物溶液剂单用组、联用组和两种不同载药的介孔二氧化硅纳米脂质体单用组,期望该介孔二氧化硅纳米脂质体载体系统可作为肝肿瘤治疗的有效手段,为肝肿瘤临床治疗提供新方法。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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