AMPK对肿瘤细胞中TGF-β信号转导及功能的抑制作用

发布时间：2019-02-24 19:23

【摘要】：背景肿瘤已成为人类健康的主要威胁,肿瘤的危害主要来自肿瘤细胞的转移。肿瘤干细胞(CSC)是肿瘤转移的种子细胞,能够在全新组织环境定植、生存、繁殖。间充质转化(EMT)是肿瘤细胞侵润、转移的启始步骤,也是已分化肿瘤细胞重获自我更新、繁殖分化潜能等干细胞特性的途径。因此,EMT/CSC被认为是肿瘤转移、耐药和复发的根源。转化生长因子-β(TGF-β)作为EMT的重要诱导因子,与肿瘤转移、血管新生、病理分期、病人预后密切相关。多种固体肿瘤中,TGF-β过量表达,并伴有下游分子表达或活性升高,活跃的TGF-β信号促进了中晚期肿瘤的发展。Bmi-1是TGF-β信号的下游靶分子之一,参与EMT和CSC自我更新的主要癌基因,与肿瘤的恶性程度、浸润转移及疗效预后都有密切关系。众多科学家相信通过调控TGF-β/Smad信号通路的活性和抑制Bmi-1蛋白表达有助于抑制EMT/CSC,发挥抑癌功能。代谢重组是决定肿瘤细胞存活的重要因素。流行病学资料表明,肥胖、糖尿病等代谢性疾病患者发生肿瘤的风险明显高于其它人群,而二甲双胍等降糖药物的应用有助降低肿瘤发生风险。多项研究表明,以二甲双胍为代表的AMPK激活剂(AICAR、苯乙双胍、A769962)具有抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力;并且AMPK主要上游激酶LKB1对恶性肿瘤转移也有明显的抑制作用,而且多种肿瘤组织的AMPK-Thr172磷酸化明显低于癌旁或正常组织。AMPK的抑癌功能是公认的,激活AMPK能够增强能量瓶颈和细胞周期检查点对肿瘤过度增殖的限制功能,抑制增殖,促进凋亡。因此,基因突变(如LKB1的突变)和肿瘤组织微环境改变所导致的AMPK活性下降成为肿瘤发展的重要原因。但目前关于AMPK对肿瘤转移、EMT的抑制机制尚未能深入研究,本研究探讨了TGF-β信号的过度活跃是否与AMPK活性下降有关,以及激活AMPK能否抑制TGF-β信号转导、EMT、Bmi-1表达等热点问题,对于肿瘤治疗有重要意义。目的探讨LKB1/AMPK对TGF-β信号转导、EMT、Bmi-1表达及细胞迁移等生物行为的抑制作用。材料与方法1、细胞株包括:胃癌细胞AGS,SGC-7901,肺癌细胞A549细胞,肺上皮细胞BEAS-2B,MEF,MDA-MB-231,NMu MG,MCF10A。2、以sh RNA敲除LKB1,或以慢病毒导入LKB1基因,构建LKB1表达不同的细胞株,给予二甲双胍等AMPK激活剂预处理,再用TGF-β1刺激,然后以免疫印迹技术检测AMPK磷酸化、Smad磷酸化以及EMT标志物的变化。3、将AMPK显性失活的突变体和显性活化的突变体转入细胞后,检测AMPK磷酸化、Smad磷酸化以及EMT标志物的变化。4、以Q-PCR检测LKB1、AMPK化学激活剂对TGF-β下游靶基因m RNA表达的影响。5、以细胞划痕或Transwell技术检测细胞迁移速率,分析激活AMPK对细胞迁移的影响。6、收集糖尿病人血清,分为服用二甲双胍和未服用患者;收集小鼠服用二甲双胍前后的血清。以ELISA技术检测人和小鼠血清TGF-β水平。7、以荧光素酶报告基因系统检测激活AMPK对TGF-β1转录水平,Smad转录调节功能的影响。结果一、AMPK对TGF-β表达的抑制作用通过萤光素酶报告基因分析发现二甲双胍、苯乙双胍处理后,TGF-β转录活性下降了50%;以ELISA分析人血清TGF-β1水平,结果表明服用二甲双胍患者的TGF-β1水平低于未服用者,但结果无统计学差异,可能受病例不足影响;进一步动物实验,发现小鼠服用二甲双胍后血中TGF-β1水平明显低于服用前;以上结果提示,激活AMPK对TGF-β生成有抑制作用。激活AMPK导致TGF-β信号转导抑制。乳腺癌细胞MCF10A和肺腺癌细胞A549LKB1中,给予二甲双胍激活AMPK可以减弱Smad2/3磷酸化水平;另外,将AMPK持续激活突变体转入A549细胞,AMPK磷酸化增强,Smad2/3磷酸化减弱。在LKB1表达缺乏细胞(如A549细胞和MDA-MB-231细胞)中转入LKB1基因,提高LKB1表达可以减弱TGF-β诱导Smad磷酸化,结果提示LKB1参与了AMPK对TGF-β信号转导的抑制作用。AMPK失活致使TGF-β信号转导增强。以显性失活AMPKa1突变体抑制C4-2细胞内源性AMPK、敲除MEF细胞中的AMPKα1和α2基因,或以sh RNA敲除乳腺癌细胞MCF10A中LKB1和AMPKα1等途径阻止AMPK活化后,TGF-β1诱导的Smad2/3磷酸化均明显增强。三、LKB1/AMPK对TGF-β诱导细胞迁移的抑制作用LKB1/AMPK对细胞迁移的抑制作用,在细胞划痕和Transwell实验中,TGF-β刺激能促进A549细胞、Nu MG细胞、AGS细胞的迁移速率,而AMPK激活剂二甲双胍和A769962对此有明显抑制作用,而且LKB1的表达可以增强这种抑制作用。抑制AMPK活性致使细胞迁移速率明显加快,通过显性失活AMPKa1突变体抑制C4-2细胞内源性AMPK活性后,细胞迁移明显加快,而以多西环素恢复AMPK功能又可以抑制细胞迁移。另外,以sh RNA敲除BEAS-2B细胞的LKB1后,细胞迁移速率明显增加。四、LKB1/AMPK对TGF-β诱导EMT的抑制作用A549细胞中,经TGF-β1长时间刺激后,上皮细胞特征的标志物E-cadherin表达下降,间质细胞特征性标志物N-cadherin和Slug表达上升;同时给予苯乙双胍和TGF-β1能抑制TGF-β1诱导EMT变化,引起E-cadherin表达水平增加,N-cadherin和Slug水平下降。乳腺上皮细胞NMu MG细胞,受TGF-β1因子刺激后,细胞形态向间质细胞转变,伴有E-cadherin表达下降,而N-cadherin,β-catenin,vimentin和Slug表达增加;二甲双胍或AICAR能减弱TGF-β所诱导NMu MG细胞的间质细胞特征,逆转以上反应。在胃癌细胞AGS中,TGF-β信号转导受二甲双胍激活AMPK的抑制后,E-cadherin逐渐增强,而N-cadherin、β-catenin、Vimentin等标志物逐渐减弱,呈时间依赖性。二、LKB1/AMPK对TGF-β诱导Smad磷酸化的抑制作用五、LKB1/AMPK对TGF-β靶基因表达的调控作用Q-PCR检测表明:二甲双胍对PAI-1、FN、CTGF、IL-6等4种TGF-β靶基因的表达水平无明显影响,而TGF-β能诱导PAI-1、FN、CTGF、IL-6等4基因的表达。但是,二甲双胍对TGF-β诱导基因表达有抑制作用,而且该抑制作用在LKB1高表达的细胞中更加明显。六、LKB1/AMPK对Bmi-1基因表达的抑制作用二甲双胍刺激A549细胞引起p-AMPK-Thr172表达升高,同时使Bmi-1的表达下降。LKB1高表达的细胞中,Bmi-1表达减弱,而LKB1低表达的细胞则Bmi-1表达更高。胃癌细胞SGC-7901和AGS受二甲双胍刺激后,p AMPK和LITAF表达上调,而Bmi-1表达下调。二甲双胍刺激能够通过LITAF使四种具有抑制Bmi-1表达的micro RNA明显升高。结论:TGF-β是诱导肿瘤侵袭转移的重要因子,LKB1/AMPK具有抑制TGF-β信号转导及其功能。激活AMPK可以抑制TGF-β信号对众多靶基因调控,阻止EMT进程,抑制β-catenin、Bmi-1等与肿瘤转移密切相关基因的表达,阻止肿瘤侵袭转移的能力。
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【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
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本文编号：2429852