慢性淋巴细胞白血病抗体协同治疗药物Ibrutinib和干扰素-γ在CLL治疗中的协同作用机制研究

发布时间：2019-03-04 13:03

【摘要】：慢性淋巴细胞白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia,CLL)在西方发达国家中发病率很高。随着我们对CLL病因和疾病发展认识的不断深入,治疗的手段逐渐倾向于开发一类靶向CLL恶性B细胞关键酶类的化学药物,而对于这些药物的作用机制和对免疫系统的影响还需要深入研究。另外,肿瘤微环境的形成与肿瘤相关巨噬细胞的异质性细胞群有关,Nurse like cells(NLCs)是具有M2表型的肿瘤相关巨噬细胞,可促进CLL恶性B淋巴细胞(B-CLL)存活并保护B-CLL免于自发性或抗体诱导的细胞凋亡。如何极化肿瘤相关巨噬细胞NLCs、使其由M2表型转变为具有正常免疫功能的M1表型免疫效应细胞,由此增强单克隆抗体免疫治疗中抗体对B-CLL的杀伤与清除也是目前的研究热点。Ibrutinib,是一种不可逆的靶向于Bruton酪氨酸激酶(Btk)的抑制剂类化学药物,目前已经用于治疗如B-CLL和B-细胞非何杰金氏淋巴瘤等B淋巴细胞癌。巨噬细胞等免疫细胞表达的Fcγ受体(FcγR)在肿瘤特异性抗体介导的涉及Btk信号通路的免疫应答中具有重要作用。本论文第二章研究了Ibrutinib在单核/巨噬细胞FcγR所介导的免疫活动中的作用。研究发现即使高浓度的Ibrutinib也不影响单核/巨噬细胞FcγR介导的吞噬作用,却会抑制FcγR介导的炎症因子的释放,同样的现象我们也从Btk突变小鼠分离得到的巨噬细胞中得到了验证。钙流(calcium flux)是Btk最主要的下游信号分子,我们通过检测细胞因子、蛋白酶磷酸化及吞噬作用详细阐述了钙流变化对免疫反应的影响,结果显示抑制细胞内钙流会降低FcγR介导的炎症因子的释放,但却不影响单核/巨噬细胞FcγR介导的吞噬作用,这说明Ibrutinib通过减少胞内钙离子浓度进而导致炎症因子水平下降。我们进一步探讨了Ibrutinib只抑制炎症反应却不影响吞噬作用的原因,在单核/巨噬细胞中,小G蛋白(GTPase)Rac负责肌动蛋白的聚合和细胞骨架重排,是免疫效应细胞发挥吞噬作用所必须的关键激酶。研究结果显示无论Ibrutinib还是Btk下游的钙离子均不影响Rac的活化,这说明Ibrutinib不影响吞噬作用的原因是Rac信号通路的活化不受Ibrutinib影响,进而推测Rac与Btk分别作用于两条信号通路。所以,抑制Btk后胞内钙离子水平降低、细胞因子水平下降,但由于Rac活性不受抑制,所以吞噬作用不受影响。关于Bt K抑制剂Ibrutinib的药物作用效果和特异性研究显示Bt K与TLR8信号通路的激活密切相关,但不参与TLR4的活化。RNA和蛋白水平检测不同的FcγR与Btk磷酸化的相关性,结果显示FcγRIIa(CD32)主要介导Btk的磷酸化。单克隆抗体免疫治疗B-CLL是临床上广泛采用的治疗手段,FcγR在抗体介导的免疫反应中不可或缺,且免疫效应细胞与抗体包被的靶癌症细胞所形成的免疫复合物直接启动并诱导免疫级联反应进而消灭肿瘤细胞。鉴于Ibrutinib抗炎却不影响机体的免疫功能,论文的第三章研究了Ibrutinib与单克隆抗体协同治疗的可行性。NK细胞大量分泌的干扰素-γ(IFN-γ)既可以杀伤抗体标记的肿瘤细胞,还可以抵消Ibrutinib对单核/巨噬细胞FcγR所介导的炎症因子的影响。针对IFN-γ作用机制的研究结果显示IFN-γ可以活化FcγR介导的下游Erk信号通路,克服Ibrutinib对免疫效应细胞Erk信号通路所造成的抑制作用。单核/巨噬细胞与NK细胞共培养、模拟体内免疫效应细胞间相互作用的研究中,Ibrutinib表现出既不抑制FcγR介导的炎症因子的产生,对免疫细胞的免疫功能也没有明显的副作用。综上,激酶抑制剂Ibrutinib只杀伤慢性淋巴细胞白血病的恶性B细胞,对巨噬细胞没有明显的副作用,Ibrutinib与单克隆抗体协同可治疗增强B-CLL的治疗效果。含有肿瘤细胞和炎性因子的CLL肿瘤微环境支持恶性B淋巴细胞的存活。CD14~+单核/巨噬细胞与B-CLL体外共培养会分化形成形状大且圆的贴壁细胞,科研人员将这类为B-CLL提供养分且支持其存活的细胞定义为Nurse like cells(NLCs)。IFN-γ具有诱导M1型巨噬细胞极化的作用,本论文的第四章阐述了IFN-γ极化NLCs的M2表型、将其转变为M1表型的巨噬细胞,从而促进细胞因子释放、提高细胞吞噬作用能力并有助于抗体对B-CLL的清除。流式细胞仪标记实验等检测结果显示IFN-γ增强NLCs M1巨噬细胞表型相关基因CD80和CD86的表达,下调与M2表型相关基因CD206的表达。此外,IFN-γ处理NLCs后活化型受体FCγRⅠ的表达水平升高,细胞吞噬作用能力增强,抗体介导的B淋巴细胞的清除效果得到显著提升。细胞活力MTT检测结果表明IFN-γ处理NLCs会增强药物对B-CLL的毒性作用,同时会减少B-CLL恶性肿瘤细胞的存活。单核/巨噬细胞在CLL肿瘤细胞微环境的影响下逐渐极化为具有TAM功能的NLCs,我们采用IFN-γ来重塑NLCs并使其极化为具有抗癌表型的正常免疫效应细胞,上述结果说明IFN-γ具有和单克隆抗体协同治疗CLL的潜力。本论文首次针对Ibrutinib这种Btk抑制剂类药物对单核/巨噬细胞FcγR介导的免疫功能的影响及相应分子机制进行了详尽阐述,阐明了Ibrutinib与单克隆抗体协同治疗CLL的可行性及临床应用潜力。我们还研究了IFN-γ极化NLCs为M1型巨噬细胞的过程中相关标志分子的变化,研究说明IFN-γ可阻断NLCs为B-CLL提供养分,极化后的NLCs可通过吞噬作用杀伤肿瘤细胞。Ibrutinib这类激酶靶向抑制剂类药物以及细胞因子IFN-γ与单克隆抗体类药物联合治疗CLL具有广泛的临床应用潜力,进一步明确IFN-γ的胞内释放途径和作用机制,提高免疫效应细胞IFN-γ的生产能力,进而阻止CLL肿瘤微环境的形成将是接下来需要深入研究的内容。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.72
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本文编号：2434289