Hedgehog通路介导难治性急性髓系白血病细胞放射线抗拒作用机制及靶向逆转研究

发布时间：2019-03-05 17:39

【摘要】：引言急性髓细胞白血病是一种造血干、祖细胞增生失调造成的恶性血液系统疾病,具有病情进展快,预后较差的特点。目前,造血干细胞移植是一种有效的治疗方法,其中全身照射(TBI)联合化疗是经典的移植前的预处理方案,可以最大程度上降低肿瘤负荷,提高疗效。但是,尽管在移植前接受了放疗和化疗,仍有20%左右的患者在移植后不久复发,在难治性白血病中的比例更高,这种现象提示难治性急性随细胞白血病细胞存在抵抗放射线的作用,且尚未被学术界充分认识。因此,研究急性髓细胞白血病细胞对放射线抗拒的机理,寻找新的治疗靶点逆转射线抵抗,进而增加细胞放疗敏感性,对提高治疗疗效具有重要意义。Hedgehog信号通路在胚胎发育进程中具有重要作用,与肿瘤的发生、细胞增殖和转移具有密切相关性。更加值得注意的是,许多肿瘤临床实验研究结果显示,Hedgehog信号通路的过表达与肿瘤治疗疗效不佳存在正相关；另外通过对胰腺癌、甲状腺未分化癌、食管癌和非小细胞肺癌等多种肿瘤的放射敏感性研究中也发现,Hedgehog信号通路的过表达可以造成肿瘤对放射治疗的抗拒,而通过下调该通路活性可以促进这些肿瘤细胞的放射敏感性。现已证实,Hedgehog信号通路可以调节许多下游基因,在生长因子信号传导、肿瘤细胞周期调控、细胞抗凋亡和组织细胞损伤修复中具有重要意义。因为这些相关基因参与的细胞活动很大程度上决定了细胞的放射敏感性,所以抑制Hedgehog通路逆转放射抗拒被认为是一种极具应用价值的潜在治疗手段。例如,在目前开展的一项基底细胞癌的临床实验中,使用抑制剂靶向阻滞Hedgehog序贯放射治疗有望成为一种新的有效的治疗策略。Hedgehog信号通路与其他信号通路之间的相互作用有助于探讨阻滞Hedgehog信号通路带来的放射增敏效应。PI3K/AKT过表达是众所周知的引起肿瘤细胞射线抵抗的主要原因,另一方面,NF-kB活化是放射线引起的DNA损伤修复过程中必不可少的因素。因此,下调PI3K/AKT和NF-kB活性是肿瘤细胞放射增敏研究中的热点。尽管Hedgehog信号通路与PI3K/AKT/NF-kB通路之间的相互作用关系尚未完全阐明,但是许多研究已经证明,Hedgehog信号通路是通过PI3K/AKT途径促进细胞生长、迁移以及上调细胞VEGF的表达,可以认为PI3K/AKT与Hedgehog信号通路的功能密切相关。另一方面,阻滞Hedgehog信号通路可以明显降低PI3K/AKT/NF-kB通路的活性。Rad51是放射线引起细胞DNA双链断裂后同源重组修复的特异性蛋白,其表达量升高往往伴随着DNA损伤修复能力的加强。既往研究显示,Rad51蛋白受PI3K/AKT调控,抑制PI3K/AKT信号途径可以降低Rad51的表达,并且另有研究已经证明该蛋白在射线抗拒的HL60细胞系中呈高表达并与射线抵抗相关,沉默该基因可以逆转细胞的射线抵抗,这也为Hedgehog通路阻滞剂逆转难治性急性髓系白血病细胞放射线的抗拒提供了理论支持。Hedgehog信号通路在白血病治疗中的作用日益受到重视。最近在一项关于成人急性髓细胞白血病的研究结果表明,Hedgehog信号通路的异常与白血病患者治疗疗效差密切相关,并且可以作为预后不良因子之一；而另一项研究报告则显示,特异性Hedgehog信号通路阻滞剂NVP-LDE225可以增加5氮杂胞苷的抗白血病细胞活性,基于此研究结果的临床实验也正在进行。也有研究发现,白血病细胞中Hedgehog信号通路表达越活跃,细胞的生存能力和耐药性越高。这些研究均显示了Hedgehog信号通路可以作为急性髓细胞白血病治疗的一个新的靶点,但是有关该信号通路与急性髓细胞白血病细胞放射敏感性之间的关系,以及如何提高放射抗拒白血病细胞放射敏感性的相关研究尚未见报道。因此在本研究中,我们假设Hedgehog信号通路与难治性急性髓系白血病细胞的放射线抗拒有关,抑制该通路可以提高细胞的放射敏感性,从而为临床应用提供理论依据。研究方法1.构建放射耐受的HL60/RX细胞：采用小剂量递增诱导照射方法,对HL60细胞株进行逐渐增加照射剂量,构建放射线抗拒的HL60细胞(HL60/RX细胞)。将HL60细胞、多药耐药的HL60/AD细胞株作为对照组细胞模型。2.HL60细胞、HL60/RX细胞和HL60/ADR细胞的放射敏感性比较：通过克隆形成实验观察细胞对放射线的敏感参数(D0, Dq, SF2)、流式细胞术检测凋亡率和激光共聚焦显微镜观察γ-H2AX方法,比较三种细胞对放射线损伤的敏感性差异。3. Hedgehog信号通路介导白血病细胞放射抗拒：为了明确Hedgehog通路是否介导了白血病细胞的放射线抗拒性,我们首先使用Western blot方法观察三种细胞中Hedgehog通路关键因子SMO和Gli-1蛋白的表达。然后使用Hedgehog通路抑制剂—-NVP-LDE225,下调HL60/RX和HL60/ADR两种细胞Gli-1水平,比较该通路阻滞后细胞放射敏感性变化,计算该药物的放射增敏比(SER)。同时使用流式细胞术和激光共聚焦显微镜,分别观察使用抑制剂后放射线诱导的细胞凋亡率和γ-H2AX表达水平。4.NVP-LDE225通过抑制Gli-1/PI3K/AKT/NF-kB途径增加白血病细胞放射敏感性：为了探讨NVP-LDE225对射线抗拒的白血病细胞放射增敏作用机理,我们将对射线抗拒的HL60/RX和HL60/ADR细胞分别分为4组：空白对照组、单用抑制剂组(10μmol/l)、单纯照射组(4.8Gy照射)和联合治疗组(10μmol/L+4.8Gy照射)。使用Western blot方法观察各组细胞治疗后Gli-1、 pAKT、NF-kB、Rad51,和BAK表达水平；并通过激光共聚焦显微镜观察NF-kB的核转位情况。5. NVP-LDE225对裸鼠移植瘤放射增敏作用：6周龄BALB/c裸鼠在SPF级环境下饲养,用于构建裸鼠移植瘤模型。常规培养射线抗拒的HL60/RX细胞和多药耐药的HL60/ADR细胞,以1×107个细胞／只数量接种于裸鼠皮下,当移植瘤大小约75-150 mm3作为成瘤标准进行后续实验。将两种细胞的荷瘤鼠分别随机分为4组：空白对照组常规饲养,单用放疗组使用4.8Gy进行照射,单用药物组使用NVP-LDE225 (80mg/kg/d,每日一次)灌胃处理,联合治疗组使用NVP-LDE225 (80mg/kg/d每日一次)灌胃,48小时后联合4.8Gy照射处理。每日测量裸鼠肿瘤长短径,按照公式：体积=0.5×长径×短径2计算肿瘤体积。放射治疗后2周处死荷瘤鼠,手术摘除肿瘤称重,标本放入固定液待用,使用免疫组化方法研究信号蛋白表达水平。6.免疫组化观察裸鼠移植瘤Gli-1, NF-kB, p-AKT,和BAK表达：将各组处理后的肿瘤组织石蜡切片,HE染色观察组织结构并使用免疫组化方法观察各组Gli-1,NF-kB, p-AKT和BAK表达水平。7.统计分析：以SPSS 22.0软件进行统计学分析。所有计量资料结果以均数±标准差表示。两组独立样本比较使用T检验方法,多组资料比较使用单因素方差分析(ANOVA)。事后多重比较,如方差齐,使用Bonferroni检验；如方差不齐,则使用Dunnett's T3检验。P值0.05认为有统计学差异。结果1.成功构建对放射线抗拒的HL60/RX细胞：经过12次小剂量递增诱导照射,在末次剂量4.8Gy照射后,成功构建了放射抗拒的白血病细胞株HL60/RX。克隆形成实验结果表明,HL60/RX和HL60/ADR细胞对放射线的耐受性明显高于HL60细胞(P0.001)。HL60细胞的Dq、D0、SF2值为1.134±0.456 Gy, 1.282±0.271Gy和0.345±0.06; HL60/RX细胞的Dq、D0、SF2值为4.513±0.804Gy,3.033±0.29 Gy和0.814±0.04; HL60/ADR细胞的Dq、DO、SF2值为3.310±0.677 Gy,2.437±0.259 Gy和0.730±0.04。HL60细胞照射4.8Gy后的细胞凋亡率为61.0%,明显高于HL60/RX (9.7%)和HL60/ADR (10.8%)(P0.001)。同时,放射抵抗的两种细胞HL60/RX和HL60/ADR接受照射后的γ-H2AX表达明显低于HL60细胞。2. Hedgehog信号通路活化介导白血病细胞对放射线抵抗的作用：Western blot检测结果表明,表现为对放射线抗拒的HL60/RX和HL60/ADR两种细胞,Hedegehog通路信号蛋白SMO和Gli-1的表达明显高于HL60细胞(P0.001)。另一方面,克隆形成实验结果显示,使用阻滞剂NVP-LDE25降低Gli-1表达后,HL60/RX和HL60/ADR细胞表现出对放射线抵抗的能力明显下降,该药物对两种细胞的放射增敏比分别为1.283 (HL60/ADR)和1.245 (HL60/RX)。另外,在使用Hedgehog通路抑制剂联合放射治疗48h后,联合治疗组总凋亡率分别达到68.2%(HL60/ADR)和60.8%(HL60/RX),明显高于未使用抑制剂组(P0.001)；激光共聚焦显微镜观察到联合治疗组y-H2AX表达水平明显高于单用放疗组(P0.001)。由此可以证明,Hedgehog信号通路介导了难治性急性白血病细胞的射线抵抗特性。3. Hedgehog信号通路阻断剂能够逆转HL60/RX和HL60/ADR细胞放射线抵抗：既往有研究证明,PI3K/AKT/NF-kB可以提高细胞放射抵抗能力。本研究结果显示,在使用NVP-LDE225 48小时后,HL60/ADR和HL60/RX细胞中Gli-1的表达水平明显低于对照组(p0.001),同时pAKT蛋白表达水平也随之明显低于对照组(p0.001),证明了Hedgehog信号通路中的Gli-1蛋白能够调节PI3K/AKT活性。同时激光共聚焦显微镜观察以及Western blot结果均表明,HL60/ADR细胞和HL60/RX细胞的NF-kB蛋白在细胞接受照射后出现明显的核转位现象,细胞核内含量明显升高(p0.001),提示在细胞照射后NF-kB活性升高,可发挥其核转录因子作用促进细胞射线抵抗功能；但是当细胞经过Hedgehog通路阻滞剂处理后,再受到射线暴露时,NF-kB核转位现象明显减弱,从而证明Hedgehog通路阻断剂可以通过下调NF-kB活性促进细胞凋亡,增加射线敏感性。我们也观察到在单纯照射组,因为细胞具有较高的Gli-1/PI3K/AKT/NF-kB活性,相应的促凋亡蛋白BAK在照射后处于较低水平；但是在使用抑制剂后联合放射治疗组,促凋亡蛋白BAK在细胞中的表达明显高于空白对照组、单用药物组和单纯放射组(p0.001),此结果与流式细胞术观察到的本组细胞高凋亡率相一致,显示了该药物具有增加射线诱导细胞凋亡作用。Rad51是细胞受到射线照射后,DNA损伤发生同源重组修复的关键蛋白,并可以通过PI3K/AKT信号进行调控。本研究结果显示,HL60/RX细胞和HL60/ADR细胞在受到照射后,Rad51表达明显高于对照组(p0.001),提示该蛋白可以促进治疗抗拒的白血病细胞射线损伤修复功能；但是在应用Hedgehog通路阻滞剂后再行照射时,Rad51表达未见升高。此结果提示在Hedgehog高表达的细胞,当细胞接受照射后,具有较高的损伤修复能力,但是在Hedgehog通路阻滞后,这种损伤修复能力明显下降。4.Hedgehog通路阻断剂在HL60/RX和HL60/ADR裸鼠移植瘤模型体内靶向治疗作用：在本研究中,我们成功构建了HL60/ADR和HL60/RX的裸鼠移植瘤模型用于动物实验。结果表明,NVP-LDE225联合放射治疗组肿瘤细胞生长速度明显慢于空白对照组、单用NVP-LDE225组和单纯照射组(p0.001)。虽然单用NVP-LDE225组和单纯照射组肿瘤生长速度略低于空白对照组,但无统计学差别。与之相应,在各组处理后14天,联合治疗组移植瘤重量明显低于其他三组(p0.001)。病理HE染色观察到联合治疗组比其他三组组织坏死面积增大。免疫组化结果与体外实验一致,无论是HL60/RX细胞移植瘤还是HL60/ADR细胞移植瘤,在使用NVP-LDE225处理后,Gli-1表达明显下降,而且pAKT和细胞核中NF-kB蛋白表达明显下降。联合治疗组肿瘤组织中BAK蛋白呈高表达,明显高于其他三组；而空白对照组与单用药物组、单纯放疗组BAK蛋白表达无差异。动物实验结果也证明了Hedgehog通路阻滞可以增加对放射线或化疗抗拒的白血病细胞的放射敏感性,其作用机制可能是与调节Gli-1/pAKT/NF-kB途径有关。结论1.HL60/ADR细胞和HL60/RX细胞中Hedgehog信号通路表达明显高于HL60细胞。相对应的,HL60/ADR细胞和HL60/RX细胞比HL60细胞具有较强的放射线抵抗能力,在抑制Hedgehog信号通路后这种抵抗能力明显下降。2. HL60/ADR细胞和HL60/RX细胞在接受放射线照射后具有较强的射线损伤修复和抗凋亡能力,在抑制Hedgehog信号通路后对放射线的损伤修复能力下降,凋亡升高。3.体外实验和动物实验表明,Hedgehog信号通路介导的放射线抵抗有可能是通过Gli-1/PI3K/AKT/NF-kB途径进行的,应用Hedgehog信号通路抑制剂能够靶向逆转抵抗射线的作用。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.71

【参考文献】