【摘要】：肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是危害我国人民健康的重大疾病之一,其发病率列全球恶性肿瘤第六位,死亡率列第三位。HCC是一种血管丰富的肿瘤,相对于其他实体肿瘤而言,其早期发现比较困难,确诊时高达90%以上的患者已属中、晚期。值得我们关注的是,HCC具有高转移性和侵袭性的特征,特别是肝内和远处转移以及频繁的术后复发,是导致其高死亡率的主要原因。为了提高早期诊断和改善预后,我们迫切需要进一步探究促进HCC发展和发生早期转移的详细机制。同时,大量的临床病例资料显示HCC的发生及进展还表现出显著的性别差异。逐渐得到的共识是雌激素在HCC的发生发展过程中起着十分重要的作用,但是,相比于其他性激素敏感器官,雌激素在肝癌中作用的研究相对较少,特别是对分子机理的探讨明显不足。因此,本研究以大量人体慢性肝炎及肝细胞癌标本为基础,结合体外实验及动物模型,系统研究了ERa及miR-30e在肝癌发生发展过程中的作用及其分子机制,获得以下主要结果：1.基于大量人类肝细胞肝癌临床标本,我们利用实时荧光定量聚合酶链反应和免疫组织化学的方法以人正常肝组织为对照,分别检测肝癌切除术后所得的肿瘤组织及相应的癌旁组织中转移相关基因1(metastasis-associated gene 1, MTA1)的表达水平,通过Kaplan-Meier曲线研究不同MTA1表达水平与HCC患者生存率及复发率之间的关系。结果发现：MTA1在肝癌组织及癌旁肝硬化组织中的转录表达明显高于正常组织(P0.01),同时,MTA1蛋白在肝癌组织及癌旁肝硬化组织中的表达也明显高于正常组织(P0.01)。通过Kaplan-Meier曲线及Log-rank检验证明MTA1能够影响肿瘤的复发及患者的生存期。本研究通过对以上实验数据的分析提示,MTA1可以作为判断肝癌肝切除术后肿瘤复发及患者生存率预测的指标。2.肝癌发病性别差异一直是国际肝癌学术界研究热点,基于大量人类肝癌标本,我们利用实时荧光定量PCR和Western blot的方法检测MTA1基因的表达水平；运用Edu掺入和Transwell、室侵袭实验分别就MTA1对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响进行评估；并利用shRNA技术和双荧光素酶报告基因实验来研究细胞系中ERa对MTA1的调控作用。结果发现,MTA1在男性HCC及癌旁组织中较正常肝组织显著性地高表达,然而,在女性患者标本中没有类似发现。并且与正常肝组织比较,ERa在男性肿瘤和癌旁组织中表达显著地降低,男性肿瘤及癌旁组织中MTA1增加量与ERa减少量呈线性相关。通过体外细胞模型及启动子活性分析表明,MTA1启动子上有3个功能性雌激素受体结合元件(ERE)的半结合位点,雌激素(E2)能够结合ERa从转录水平抑制肝癌细胞中MTA1的表达。过表达ERa可抑制肝癌细胞的增殖和侵袭能力；另一方面,过表达MTA1可以减弱ERa介导的对肝癌细胞增殖和侵袭的抑制作用以及其在体内实验中,对肿瘤形成的抑制作用。这表明,ERa和MTA1之间存在反馈调节关系。总之,我们的结果表明,ERa通过下调MTA1基因的转录,抑制了人肝癌细胞的增殖和侵袭能力。因此,通过本研究我们阐明了另一条可用于解释肝癌发病性别差异性的通路：男性肝癌及癌旁组织中ERa下调,从而使处于肝硬化和癌变早期的肝细胞失去雌激素的保护作用,并导致MTA1高表达,最终通过其下游信号通路激活导致肝癌的在男性中高发。3.已知MTA1是一个典型的转移相关蛋白,它在上皮-间质转化(EMT)发生的过程中是至关重要的,然而,涉及其上、下游调控机制的相关知识我们还知之甚少。本研究中,我们致力于探讨在人类肝细胞癌(HCC)中MTA1上游的调控因子和其下游的效应靶点以及其作用机制。实验中我们采用实时荧光定量聚合酶链反应和免疫组化的方法检测不同基因的表达水平,应用统计学分析和生物信息学方法来预测它们之间潜在的相关性和调控关系,并进一步通过体内和体外实验以验证上述调控关系。我们的研究纳入了总共94对HCC肿瘤和癌旁组织样本,检测结果表明,在人类HCC中,miR-30e的减少与MTA1的增加相关联,miR.-30e可以结合在MTA1基因的3'端非翻译区(3'UTR)从而在转录后水平调控MTA1的表达,并与EMT的发生负相关。进一步的,在人类HCC中,MTA1的显著高表达与ErbB2的过表达相关联,MTA1可与组蛋白去乙酰化酶(HDAC2)结合形成复合物作为一个转录因子促进ErbB2的转录。MTA1促进EMT发生的效应很大程度上依赖于ErbB2,体内和体外实验均表明或是沉默或是抑制了ErbB2的活性,可以显著地减弱由过表达MTA1所介导的EMT的发生。总之,我们的研究表明,在人类HCC中miR-30e的下调可以增加MTA1的表达,并进一步地通过增加ErbB2的表达促进了肝癌细胞的侵袭和转移。综上所述,通过我们的研究表明,MTA1不仅参与肝细胞癌的发生发展,而且与其术后复发、预后不良以及低生存率等临床特征密切相关。一方面,ERa在男性肝癌及癌旁组织中下调,通过转录水平的调控,导致MTA1高表达,有利于增强肝癌细胞的增殖和侵袭能力,影响肝癌恶性程度及转移潜能等生物学特性；另一方面,在人类HCC中下调的miR-30e也可以在转录后水平调控MTA1的表达,并进一步地通过增加ErbB2的表达,促进EMT的发生进而增强了肝癌细胞的侵袭和转移。这些结果有利于我们更深入了解MTA1促进肝癌发生发展的机制,增加对肝癌发生发展中性别差异性的理解,同时也为肝癌的预防和治疗提供了新靶标。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
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本文编号：
2445588
