急性T淋巴细胞白血病中LMO2基因重排的研究

发布时间：2019-04-03 20:48

【摘要】：目的1.检测264例初诊急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)患者LMO2基因重排的发生率,同时检测重排阳性组和阴性组患者LMO2等9种原癌基因m RNA的表达水平,明确LMO2基因重排与其表达水平是否有相关性。另外,对部分患者进行NOTCH1等多种基因突变检测及芯片-比较基因组杂交(array-CGH),明确LMO2基因重排和其他基因突变、DNA拷贝数变化之间的关联性。2.应用全基因组测序(WGS)技术检测2例LMO2基因重排阳性T-ALL患者的对手基因,并阐明致病机制。方法1.收集264例初诊T-ALL患者的骨髓细胞,应用短期培养法制备染色体悬液,采用R显带进行核型分析。采用荧光原位杂交(FISH)技术和实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)技术分别检测264例T-ALL患者LMO2基因重排发生情况和49例T-ALL患者LMO2等9种原癌基因m RNA表达水平。利用DNA抽提试剂盒(Invitrogen公司生产)抽提基因组DNA,应用PCR扩增基因组DNA,同时采用PCR产物双向测序的方法分析88例T-ALL患者NOTCH1等疾病相关基因突变情况。对22例有足量DNA样本的T-ALL患者,应用芯片-比较基因组杂交技术(array-CGH)检测DNA拷贝数变化。最终,综合分析LMO2基因重排、表达、基因突变、DNA拷贝数变化之间的关联性。2.收集2例LMO2基因重排阳性的T-ALL患者冻存的骨髓细胞,应用DNA抽提试剂盒(Invitrogen公司生产)抽提基因组DNA,送检至少4μg DNA于上海伯豪生物技术有限公司进行全基因组测序。通过该检测公司对测序结果进行深入分析,明确2例T-ALL患者LMO2基因的对手基因,并分析其参与致病机制。结果1.264例T-ALL患者中LMO2基因重排、基因表达、基因突变和array-CGH变化等情况264例初诊T-ALL患者经FISH技术检测,发现LMO2基因重排阳性的有24例,阳性率为9.1%,其中男性21例,女性3例。12例病人通过核型分析发现有累及人类染色体11p12-13的异常,包括10例病人核型结果为常见的t(11;14)(p13;q11)(10/264,3.8%),2例病人核型结果为del(11p12)。本组T-ALL患者中,LMO2基因隐匿性重排比率为4.5%(12/264)。LMO2基因重排阳性组与阴性组患者相比较,年龄更小(18岁)、血红蛋白值、乳酸脱氢酶值、异常核型比例更高(P值均0.05),而在不同的性别、骨髓原始细胞比例、外周血白细胞及血小板水平方面,均无统计学差异(P值均0.05)。对于上述的24例LMO2基因重排阳性的T-ALL患者,我们同时应用由BAC克隆RP11-242H9(标记红色荧光素)和RP11-256C2(标记绿色荧光素)制备而成的TCRA/D基因的探针行FISH检查,结果发现,10例T-ALL患者核型结果中包含t(11;14)(p13;q11),核型分析和FISH验证基本一致,另外有4例T-ALL患者也同时检测出LMO2和TCRA-TCRD基因重排,提示隐匿性的t(11;14)(p13;q11)。24例LMO2基因重排阳性的T-ALL患者中,有14例(58.33%)患者明确为染色体易位t(11;14)(p13;q11),包含10例核型已经发现的t(11;14)(p13;q11)和4例隐匿性的LMO2和TCRA-TCRD基因重排。我们通过全基因组测序方法发现一例T-ALL患者同时存在LMO2和TCRB基因重排,这一发现促使我们在上述24例LMO2基因重排阳性的T-ALL患者中进行TCRB基因重排的筛查。我们应用BAC克隆RP11-1084E14和RP11-114L10制备的FISH探针行进一步检查,发现2例T-ALL患者存在TCRB基因重排,包含上述的通过全基因组测序发现的t(7;11)(q35;p13),还有1例T-ALL患者也同时检测出LMO2和TCRB基因重排。而该患者也检测出了TCRA-TCRD基因重排,结合该患者的核型结果中包含t(8;14)(q24;q11),我们推测TCRA-TCRD基因重排并不是与LMO2基因断裂融合而成的,而是与位于8q24的MYC基因发生了融合,我们应用了BAC克隆RP11-440N18制备的FISH探针进行验证。结果与我们推测的一致,TCRA-TCRD基因与MYC基因发生了融合,而LMO2和TCRB基因发生了融合。我们选取了49例(10例患者LMO2基因重排阳性,39例患者LMO2基因重排阴性)有足量冻存细胞的T-ALL患者样本,提取了足量的总RNA,逆转成c DNA后进行LMO2、TAL1、LYL1、STAG2、SEPT1、TLX1、TLX3、LEF1、MEF2C(44例患者行MEF2C检测)等9个T-ALL相关的癌基因的表达水平的检测。结果发现,LMO2基因重排阳性组患者和阴性组患者相比较,LMO2(P=0.02)、LEF1(P=0.015)基因表达水平较高,而MEF2C(P=0.04)基因表达水平较低,其余6个基因表达水平没有统计学差异(P0.05)。对于264例进行LMO2基因重排检测的T-ALL患者,我们选取了88例有足量冻存细胞的患者样本,提取了基因组DNA,进行LMO2、FBXW7、IL7R、NOTCH1、PHF6、WT1等基因突变检测。88例患者中,13例患者LMO2基因重排阳性,75例患者基因重排阴性。通过检测,我们发现43例病人(48.9%)没有检测到突变,25例病人(28.4%)存在一个基因突变,20例病人(22.8%)有一个以上基因突变。FBXW7、IL7R、NOTCH1、PHF6、WT1基因突变分别在8/88(9.1%)、4/88(4.5%)、40/88(45.5%)、12/88(13.7%)和4/88(4.5%)的T-ALL患者中发现。其中,8例T-ALL患者中2例患者FBXW7基因突变单独发生,另外6例同时存在NOTCH1基因HD区域基因突变。4例T-ALL患者检测出IL7R基因6号外显子的突变,该突变导致IL7R蛋白跨膜区域的氨基酸残端P240 S246的插入或者置换。NOTCH1基因突变在40例患者中检测到:62.5%患者HD区域发生基因突变,25.0%患者PEST区域发生基因突变,7.5%患者基因突变发生区域在HD和PEST共同区域,另有5%患者基因突变发生在TAD区域。12例T-ALL患者PHF6基因突变发生情况如下:2例错义突变,4例移码突变,6例无义突变。其中2例患者在相同的碱基位置发生基因突变成终止密码子,其他的基因突变类型文献中均有过报道。4例T-ALL患者WT1基因突变发生情况:1例患者在9号外显子462位氨基酸发生了错义突变(R462W),而其他的患者均在7号外显子区域发生移码突变。88例患者中,均未检测到LMO2基因突变。但是,我们发现LMO2基因的2个SNP位点(rs2038602和rs3740617)。而LMO2基因重排阳性患者和重排阴性患者,FBXW7(P=0.168)、IL7R(P=0.252)、NOTCH1(P=0.956)、PHF6(P=0.265)和WT1(P=0.252)基因突变的发生情况无明显统计学差异。对于22例有足量基因组DNA的T-ALL患者,我们进行了比较基因组杂交检测,从而发现这些患者DNA拷贝数的变化。通过检测我们发现,22例T-ALL患者有1种或以上的基因组水平的异常,一共有87种基因组水平的改变或者缺失,平均每个病人有3.9种异常。在这些异常中,发生率最高的是CDKN2A基因的缺失(36.4%,8/22)。融合基因SET-NUP214、SIL-TAL1、NUP214-ABL1的发生率分别为13.6%(3/22)、9.1%(2/22)、4.5%(1/22)。我们发现多种参与到白血病疾病发生发展的基因DNA拷贝数变化,如MYB基因的扩增(1/22,4.5%),CDKN2A(8/22,36.4%)、WT1(3/22,13.6%)、LEF1(2/22,9.1%),LMO2(2/22,9.1%)、RB1(1/22,4.5%)、PHF6(1/22,4.5%)、ETV6(1/22,4.5%)等基因的缺失。我们用BAC克隆RP11-646J21和RP11-278N12制备的FISH探针,验证出array-CGH发现的2例T-ALL患者中LMO2基因上游的微缺失。2.2例LMO2基因重排阳性的T-ALL患者LMO2对手基因研究情况通过全基因组测序检测及后期结果验证,发现病例1的LMO2基因所在的11号染色体与TCRB基因所在的7号染色体同时发生了断裂并重新连接,因此初步推测为染色体易位t(7;11)(q35;p13)。我们首先应用BAC克隆RP11-1084E14和RP11-114L10检测病例1是否发生了TCRB基因重排,结果显示该病例TCRB基因重排阳性。接着,我们根据全基因组测序的结果分别应用BAC克隆RP11-646J21和RP11-114L10检测该病例是否同时发生LMO2基因和TCRB基因融合,结果显示为融合阳性。我们设计出LMO2基因融合位置的PCR引物,经过基因组DNA水平的PCR及PCR产物测序,我们发现病例1确实为染色体易位t(7;11)(q35;p13),LMO2基因的对手基因为TCRB基因。病例2的LMO2基因所在的11号染色体与14号染色体长臂3区2带同时发生了断裂并重新连接,因此初步推测为染色体易位t(11;14)(p13;q32)。该患者14q32区域断裂位点位于BCL11B基因下游,我们根据全基因组测序的结果分别应用BAC克隆RP11-2348N10和RP11-74H1检测该病例是否发生BCL11B基因重排,结果显示为重排阳性。因此,病例2同时发生了LMO2和BCL11B基因重排,LMO2基因的对手基因为BCL11B基因。我们设计出LMO2基因融合位置的PCR引物,经过基因组DNA水平的PCR及PCR产物测序,我们发现病病例2确实为t(11;14)(p13;q32)。结论1.本试验通过对T-ALL患者中LMO2基因重排进行筛选,发现在T-ALL中LMO2基因重排是一种再现性较高的事件,LMO2基因重排阳性的T-ALL患者该基因表达也相对较高,LEF1基因表达具有相互促进的作用。LMO2基因重排与NOTCH1等基因突变之间无相关性,提示T-ALL患者中LMO2基因重排是主要遗传学事件。2.通过全基因组测序技术对2例LMO2基因重排阳性的T-ALL患者进行LMO2基因断裂位点的精确定位和对手基因的检测,发现了在T-ALL中一种新的染色体易位t(11;14)(p13;q32)以及LMO2基因的对手基因-BCL11B。这种新的易位通过与BCL11B基因3’端的增强子的并置,导致LMO2基因的活化,参与T-ALL的致病。
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【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71

【参考文献】