当归多糖调控CML患者骨髓间充质干细胞衰老抑制白血病干细胞增殖的机理研究

发布时间：2019-04-03 21:14

【摘要】：背景干细胞具有自我更新和多向分化能力,这是维持组织和器官结构与功能稳态的关键因素之一。人体衰老和老年性疾病的发生、发展与机体干细胞衰老有密切关系。研究证明。造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)衰老与多种老年性疾病密切相关,主要表现为造血系统衰退所致的严重贫血,免疫系统低下所致的防御功能降低,细胞增殖分化失控所致的白血病发生等。研究证明,随着年龄的逐步增加,造血诱导微环境的生态龛数量减少和功能衰退,进而导致HSC数量减少和功能低下,最终伴随相关老年性疾病的发生。因此干细胞是研究细胞衰老的重要模型,深入研究干细胞衰老和延缓干细胞衰老的现代生物学机理,不仅对推动人体衰老问题的研究有重大的科学意义,而且在预防老年疾病和治疗退行性疾病中有不可估量的社会价值。造血诱导微环境(HIM)是HSC赖以生存和增殖分化的场所,HIM不仅是HSC生存的支架,它还产生诸多造血调控因子,影响细胞信号转导对其功能起着重要调控作用。现代造血理论认为,HIM的核心成分是骨髓基质细胞,它构成特定的生态龛调控HSC的功能,骨髓基质细胞是多种细胞组成的混合细胞群,它们大多起源于骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCS)。因此阐释造血干细胞衰老机制需要同步研究BMSCS对其衰老的影响。慢性髓细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是一种造血干细胞克隆增生性疾病,骨髓以髓系细胞增生,外周血以白细胞增多和脾肿大为主要特征,以老年人的患病率较高。研究证明,白血病的发生发展与白血病干细胞(leukemia stem cell,LSCS)密切相关。目前认为,LSCS由正常HSC演化而来,尤其HSC衰老或HIM变化是形成LSCS的关键因素,同时LSCS也是临床治疗白血病的难点所在。迄今白血病的根治除了HSC移植外没有理想的治疗手段,但该治疗手段复杂,尤其是难以获得理想的供体细胞,且花费巨大,大多数患者并没有治疗机会。如何治愈白血病仍是医学界难以攻克的瓶颈。如果寻找到既能抑制白血病细胞增殖分化,又能对骨髓正常造血细胞有良好保护作用的天然药物有效成分将对白血病等肿瘤的治疗带来新的治疗途径。当归是中医临床“补血、活血”要药,当归多糖(ASP)是其主要药物活性成分之一。我们多年的研究证明,ASP对HSC的增殖分化有重要调控作用,且可以延缓HSC衰老,促进贫血动物骨髓造血功能,对免疫器官有良好保护作用。最近我们研究发现,ASP能促进LSCS的衰老,对移植性白血病有较好的治疗效果。但ASP的“双向调节”作用机理尚不清楚。目的本文将现代干细胞最新理论和技术与传统中医“气血理论”和衰老理论结合研究如下内容1.随年龄增加小鼠与人骨髓HSC/HPCS与BMSCS衰老的生物学特点;2.ASP调控骨髓间充质干细胞对LSCS的影响;3.ASP调控BMSCS衰老抑制LSCS作用机理。研究对阐释干细胞衰老理论和中医学“气血理论”有重要的理论价值;对临床治疗白血病有重要的应用价值。方法1.雄性C57BL/6小鼠,分为幼年组(A组,3~4周龄),青年组(B组,2月龄),中年组(C组,6月龄),中老年组(D组,12月龄),老年组(E组,18月龄)。提取各组小鼠骨髓单个核细胞,用本课题组改良MACS分离法分选纯化Sca-1+细胞群。衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色观察各年龄组阳性细胞百分比,造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养比较各年龄组Sca-1+细胞集落形成能力。2.取正常人骨髓,分为青年组(3例,26~31岁),中年组(3例,52~59岁)与老年组(3例,62~70岁),改良MACS分选出各组骨髓CD34+CD38-细胞,流式细胞术检测其纯度,台盼蓝染色检测细胞存活率,SA-β-gal染色检测各组细胞衰老情况。3.分离各组人骨髓单个核细胞,体外贴壁培养14-21天,倒置镜下计数细胞数50的成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)个数。取第3代BMSCS,流式细胞术检测CD34,CD45,CD73,CD90,and CD105细胞表型,SA-β-gal染色观察各年龄组阳性细胞百分比,CCK-8检测比较各年龄组BMSCS形成CFU-F的能力。4.取正常人骨髓3例。慢性髓细胞白血病患者骨髓5例,分别分为对照组与ASP组。对照组,进行常规培养;ASP组,在培养体系中加10μg/ml当归多糖,其它条件同于对照组。分别计数各组CFU-F数量,CCK-8检测各组BMSCS增殖情况,SA-β-gal染色检测衰老细胞阳性率。碱性磷酸酶染色检测各组BMSCS的成骨分化能力,油红O染色检测BMSCS成脂分化能力。5.检测上述各组BMSCS内SOD,总谷胱甘肽,MDA,超氧化物的含量,观察各组细胞的氧化损伤及抗氧化能力。Elisa检测血管生成素Ⅰ含量,了解各组BMSCS的对造血系统的支持作用。6.RT-PCR和Western blotting检测各组人BMSCS衰老相关基因p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1m RNA及衰老相关蛋白P16INK4a、P21Cip1/Waf1、P19、P53表达的改变。7.将培养了三代的各组BMSCS分别加入到带Transwell的六孔板的下层,将LSCS分别加入transwell的上层,每孔各106个LSCS。培养24h,取出上层的CD34+CD38-细胞进行CFU-Mix培养及CCK-8增殖能力检测。结果1.MACS分选前小鼠Sca-1+细胞百分比为(1.02 0.19)%;MACS分离纯化后Sca-1+细胞纯度可达(93.66±0.83)%。各年龄组分选前后Sca-1细胞纯度百分比无统计学差别。MACS分离纯化前每106个BMNCs中CD34+CD38-细胞群比例为1.76±0.34%;MACS分离纯化后每106个细胞中CD34+CD38-细胞群比例为91.15±2.41%。各组人BMSCS高表达CD73,CD90,CD105抗原,低表达CD34,CD45抗原。2.青年组,中年组与老年组人每107个BMNS形成CFU-F能力随年龄增加逐渐下降;人CD34+CD38-细胞形成CFU-Mix数量随年龄增加逐步下降降低,集落中的细胞数也逐渐减少;人BMSCS的SA-β-gal染色阳性率随年龄增加逐渐升高。幼年组,青年组,中年组,中老年组和老年组小鼠Sca-1+HSC/HPCSs形成CFU-Mix数量随年龄增加逐渐降低,集落中细胞数也逐渐减少;SA-β-gal染色小鼠BMSCS阳性细胞数随年龄增加逐渐升高。小鼠或人BMSCS的增殖情况均随年龄呈现逐步降低趋势。3.LSCS与BMSCS共培养结果表明,空白对照组和白血病组的LSCS集落数量明显高于其它组,集落中细胞数也高于其它组。ASP组LSCS集落数量明显少于白血病组,提示ASP干预的BMSCS有抑制LSCS增殖的作用,ASP作用BMSCS可以延缓其衰老。4.CML患者的BMSCS与健康人的BMSCS比较,形成CFU-F能力下降,而ASP作用CML患者的BMSCS后,形成CFU-F能力明显提高。SA-β-gal染色阳性的人BMSCS数在白血病组显著增加,而ASP组的SA-β-gal染色阳性的细胞数明显降低。白血病组的BMSCS成骨、成脂分化能力明显降低,而ASP组的BMSCS成骨、成脂分化能力明显高于白血病组。白血病组BMSCS的SOD,总谷胱甘肽与血管生成素Ⅰ含量明显降低,而MDA及超氧化物均明显增高,而ASP组BMSCS的SOD,总谷胱甘肽与血管生成素Ⅰ的含量明显提高,而MDA及超氧化物均明显降低。说明CML患者BMSCS较健康人的BMSCS出现明显衰老,而ASP可以延缓其衰老。5.PCR结果显示p16INK4a,p19Arf,p53,p21Cip1/Waf1基因在各组人BMSCS中均有表达,白血病组p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1m RNA表达水平显著高于其它各组,ASP组相应基因表达水平低于白血病组,Western Blot结果提示各组人BMSCS均有所表达P16INK4a、P21Cip1/Waf1、P53、P19蛋白,白血病组表达明显增高,ASP组相应蛋白表达低于白血病组,提示ASP能延缓人BMSCS衰老,其机理可能与ASP调控p16INK4a-Rb和p19Arf-Mdm2-p53-p21Cip1/Waf1信号通路有关。结论1.随年龄增加小鼠和人类的HSC及BMSCS均会出现衰老,表现为增殖分化能力下降等,这两种细胞的衰老可能存在相互关联。2.随着年龄的增加,人骨髓间充质干细胞出现衰老,对造血系统尤其是造血干细胞的支持作用下降,这可能会导致造血干细胞变成增殖性很强的白血病干细胞,于是患上白血病。且有白血病干细胞的存在,白血病的治疗效果不好,容易复发。本部分实验提示当归多糖可能可以通过延缓间充质干细胞衰老抑制白血病干细胞的增殖分化,进而抑制白血病干细胞的产生,降低慢性髓细胞白血病的患病率。3.当归多糖可以调控CML骨髓间充质干细胞衰老,从而抑制白血病干细胞的增殖,其可能的机理是通过提高细胞的抗氧化能力和降低细胞氧化损伤。也可能与p16INK4a-Rb和p19Arf-Mdm2-p53-p21Cip1/Waf1信号通路的调控有关。这个发现可以成为我们今后探索治疗CML的新方法的新途径。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.72

【参考文献】