柴胡皂苷d对人前列腺癌DU145细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用及机制研究

发布时间：2019-04-04 07:58

【摘要】：前列腺癌在全球范围内是男性最常见的癌症之一,每年都有大量的新发病例和死亡病例,不仅危害人们的生命,还给家庭和社会带来沉重的经济负担。在中国前列腺癌的发病率在逐年上升,且由于临床症状隐匿,诊断时常已是中晚期前列腺癌。晚期前列腺癌经内分泌治疗一段时间后常转变成雄激素非依赖性和雄激素抵抗性前列腺癌,目前临床上尚无有效的治疗方法,预后差,因此迫切需要寻找新的治疗药物和治疗方式来治疗这类前列腺癌。中国的传统中药作为天然产物,历史悠久,应用范围广,疗效温和,在防治肿瘤方面取得了重大成就,具有不良反应低、毒副作用小的特点。因此从中草药或其天然产物及其衍生物中寻找具有高选择性和低毒副作用的抗肿瘤药物已经成为目前研究者关注的焦点。柴胡皂苷(Saikosaponin,SS)是从柴胡属falcatum L.(伞形科植物)的根部提取出来的三萜皂苷。由于所有的柴胡皂苷均有一般类固醇样结构,它们已经被证实有一些类固醇相关的药理学活性。柴胡皂苷d(Saikosaponin d,SSd)被认为是柴胡皂苷药理活性最强的亚型。研究报道SSd具有抗肿瘤、抗炎、治疗肾病及抗肝纤维化等多种药理活性,是一种具有重要应用价值的天然化合物。近年来,许多中药研究者进行了SSd在体内外肿瘤筛选实验的研究,证实了SSd对多种肿瘤具有抑制作用。研究报道SSd可有效抑制乳腺癌、肝细胞癌、肺腺癌等细胞的增生,并诱导凋亡。然而SSd对人前列腺癌的作用还未见报道。因此,本实验将应用雄激素非依赖性前列腺癌细胞系DU145细胞为研究对象,研究和探讨SSd对DU145细胞的影响及相关作用机制。PI3K/AKT信号通路和MAPK/ERK信号通路作为掌控细胞命运的信号通路,具有调控细胞增殖、分化和凋亡的功能。我们同时研究了SSd对这两个通路中的活性成分-磷酸化的AKT和ERK蛋白及共同下游蛋白叉头框蛋白O3a(forkhead box protein O 3a,FOXO 3a)蛋白表达的影响。本实验将通过MTT法、形态学观察和Ki67免疫细胞化学染色等方法观察SSd对DU145细胞活力的影响;通过流式细胞术和Western blot测定SSd对细胞周期的影响;通过Hoechst 33258荧光染色、HE染色、流式细胞术和Western blot等方法测定SSd对细胞凋亡的影响;并探讨细胞周期阻滞和凋亡诱导的相关作用机制。通过台盼兰染色观察其对原代培养的小鼠脾细胞的毒性作用,以此评价它对正常细胞的毒性作用。研究结果如下:1.MTT法和Ki67免疫细胞化学染色方法显示SSd可抑制DU145细胞的活力并呈剂量依赖性;2.Hoechst 33258荧光染料染色、HE染色和流式细胞术的结果显示SSd可诱导细胞发生凋亡,并呈剂量和时间依赖性;3.流式细胞术结果显示SSd使DU145细胞周期阻滞于G0/G1期,并且呈现浓度和时间依赖性;4.在加入Caspase广泛抑制剂Z-VAD-FMK后用SSd处理细胞显示细胞周期没有明显改变,而细胞凋亡明显受到抑制;5.流式细胞术结果显示SSd对DU145细胞内ROS并无明显变化;6.流式细胞术结果显示SSd使DU145细胞MMP下降,并呈浓度依赖性;7.Western blot分析显示SSd显著上调DU145细胞内Bax蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达,增加细胞质内Cyto c的水平,并诱导Caspase-3的活化;8.Western blot分析显示SSd上调DU145细胞内p53和p21蛋白的表达,下调Cyclin D1及其CDK4、CDK6的表达水平;9.SSd以浓度依赖性的方式下调磷酸化的AKT和磷酸化的ERK蛋白的表达,并下调FOXO3a蛋白磷酸化的水平。因此,我们得到以下结论:1.我们首次揭示了SSd可以抑制人前列腺癌DU145细胞的活力,此抑制作用是通过诱导凋亡和阻滞细胞周期于G0/G1期来完成的,呈剂量和时间依赖性;2.SSd对DU145细胞的凋亡诱导作用是通过线粒体途径来调控的,包括上调促凋亡蛋白Bax和下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,从而使MMP耗散、Cyto c的释放增加,激活Caspase-3来实现的;3.SSd对DU145细胞的细胞周期阻滞作用与上调p21、p53蛋白的表达,下调Cyclin D1和CDK4、CDK6蛋白的表达水平有关;4.SSd诱导DU145细胞发生凋亡是抑制细胞活性的主要原因,细胞周期阻滞是抑制细胞活性的次要原因;5.SSd可减少磷酸化的ERK和AKT的表达,抑制FOXO3a蛋白的磷酸化水平,而FOXO3a是抑癌基因,它作为转录因子在调节细胞周期和凋亡过程中发挥重要作用。因此推测SSd或许是通过调节FOXO3a蛋白的表达来发挥抑制作用。我们的实验结果证实了SSd对人前列腺癌DU145细胞的抑制作用,并研究了相关作用机制,为SSd发展成为可能的前列腺癌的有效治疗药物提供理论基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25

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本文编号：2453627