【摘要】：根据美国癌症协会的最新数据显示,无论是发达国家还是发展中国家,肿瘤已然成为一个世界性的健康问题。而且即使是在世界范围内,肝癌的发病率仍然在所有肿瘤疾病中名列前十。中国作为一个乙肝大国,有着较高的肝癌发病风险。据美国癌症协会统计,截至2015年,肝癌在我国所有肿瘤相关疾病中的发病率名列前五,且在男性患者中排名第三。而作为恶性程度较高的肝癌,往往发现较迟,且限于各种原因,患者不能得到较好较及时的手术治疗。由此,发现更多肝癌治疗手段的任务迫在眉睫。磷酸二酯酶(PDEs)是一组有着11个基因亚型,能够特异性水解环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP),从而影响cAMP和cGMP所参与介导的cAMP/PKA通路和cGMP/PKC通路,最终调控有关激素以及信号通路的基因家族。已有的研究结果表明,PDE7A在肝脏细胞中有明显表达,且能够相对特异性的参与水解cAMP,通过改变cAMP在细胞内的水平,进一步间接的调控细胞的增殖、生长、凋亡等生物学行为。这也就意味着在肝细胞肝癌中对PDE7A的深入研究在肝癌的诊疗进展上有着明显的促进作用。第一部分磷酸二酯酶7A(PDE7A)具有促进肝癌细胞增殖和迁移的能力目的：磷酸二酯酶7A (PDE7A)是磷酸二酯酶家族(PDEs)中的一员,它在肝脏、头颅等组织器官中均有着一定量的表达与分布。和大部分的PDEs成员一样,PDE7A能够特异性的水解cAMP,从而影响cAMP所参与调节的下游通路的表达。异常的细胞周期,无限的增殖,以及突出的迁移侵袭能力是肿瘤所共有的突出特点,根据已有的研究结果显示,PDE7A很有可能表现出类似肿瘤基因的作用,并且在恶性肿瘤的过度增殖、侵袭转移等各方面发挥出不同的作用。本实验希望能够进一步明确PDE7A在肝癌细胞中对增殖、迁移等方面的具体影响。方法：首先通过浙江大学医学院附属第一医院肝癌患者的标本资料库提取90名肝癌患者的癌组织和癌旁组织,对其进行免疫组化检测PDE7A的含量；对90名患者的术后生存期做长达五年的随访并做PDE7A相关的生存曲线分析。利用Western blotting技术对目前常用的肝癌细胞系,如HepG2、SK-Hep-1、HCC-LM3、 SMMC-7721和Huh-7等检测PDE7A的表达量水平,确定实验用细胞系。通过小干扰RNA(siRNA)技术抑制PDE7A在肝癌细胞中的表达量水平,构建PDE7A正常表达组和PDE7A低表达组模型。利用流式细胞术分别检测PDE7A正常表达组和PDE7A低表达组中细胞周期分布的变化；利用Western blotting技术分别检测PDE7A正常表达组和PDE7A低表达组中有关的细胞周期调控蛋白的表达量水平。通过划痕实验以及Transwell实验比较PDE7A正常表达组和PDE7A低表达组中细胞侵袭迁移能力的差异。EdU技术以及CCK8技术检测比较PDE7A正常表达组和PDE7A低表达组细胞增殖能力的差异。结果：在我们所统计的90对肝癌组织和癌旁组织中,免疫组化的结果显示约有53对组织中肝癌组织内PDE7A的表达量高于癌旁组织。对90名患者手术后的生存分析结果显示PDE7A高表达的患者五年存活率(27.9±6.2)明显小于PDE7A低表达组的患者(55.4±8.9)。在常见的肝癌细胞系中,我们发现HCC-LM3细胞中PDE7A的表达量相对较高。通过siRNA技术,我们对HCC-LM3细胞构建了PDE7A正常表达组和PDE7A低表达组。Western blotting结果显示PDE7A低表达组中周期相关蛋白的表达量较PDE7A正常表达组有明显的下降。流式细胞术结果显示PDE7A低表达组中细胞周期大量阻滞在G2期。划痕实验以及Transwell结果提示PDE7A低表达组中细胞侵袭迁移能力受到了明显的抑制。EdU技术和CCK8检测结果均提示PDE7A低表达组中细胞增殖能力较PDE7A正常表达组明显下降。结论：肝癌组织中PDE7A的表达量水平相对癌旁组织要高；肿瘤组织中PDE7A表达水平低的患者5年生存率相对要高；PDE7A低表达的HCC-LM3细胞周期相关蛋白的表达量水平也相对较低；PDE7A低表达的HCC-LM3细胞周期相对较多的阻滞在G2期；PDE7A低表达的HCC-LM3细胞侵袭迁移的能力相对受到明显的抑制；PDE7A低表达的HCC-LM3细胞的增殖能力受到明显的下调。第二部分磷酸二酯酶7A (PDE7A)促进体内外肝癌细胞的Warburg效应抑制其凋亡目的：比较在体内环境以及体外环境中,PDE7A表达量水平的高低对肿瘤细胞的生长、肿瘤细胞的凋亡,以及对肿瘤特征性的Warburg效应的影响。方法：利用第一部分中建立的PDE7A正常表达组和PDE7A低表达组,我们通过流式细胞术比较PDE7A正常表达组和PDE7A低表达组中细胞的凋亡水平的差异。利用Western blotting技术比较PDE7A正常表达组和PDE7A低表达组中凋亡相关蛋白的表达水平变化。通过检测比较PDE7A正常表达组和PDE7A低表达组中乳酸含量的差异,比较体外环境中Warburg效应的差异。利用裸鼠皮下成瘤技术,构建PDE7A正常表达和PDE7A低表达的体内模型,通过比较体内模型中PDE7A正常表达组和PDE7A低表达组肿瘤生长的大小、质量,比较PDE7A在体内对肿瘤细胞生长的影响。通过免疫组化技术比较体内模型中PDE7A正常表达组和PDE7A低表达组形成的肿瘤中凋亡相关蛋白的表达量水平差异。通过免疫组化技术比较体内模型中PDE7A正常表达组和PDE7A低表达组形成的肿瘤中Warburg效应强度的差异。结果：根据流式细胞术的结果,体外实验中PDE7A低表达组中,细胞的凋亡水平明显增高；根据Western blotting的结果,体外实验中PDE7A低表达组中,细胞凋亡相关的蛋白表达水平明显增高；根据乳酸产量的测定结果,体外实验中PDE7A低表达组中,细胞Warburg效应受到明显的抑制。在体内实验的模型中,PDE7A低表达组的肿瘤细胞生长速度明显受限；PDE7A低表达组的PARP表达量明显增加；PDE7A低表达组中的Warburg效应明显减弱。结论：本实验证明了在体外模型中PDE7A表达量的降低可以促进细胞凋亡相关蛋白的表达量水平升高；可以促进肿瘤细胞的早期凋亡；可以明显的抑制肿瘤的Warburg效应。在体内模型中,同样的PDE7A低表达组可以明显的抑制肿瘤的生长；能够促进凋亡相关蛋白的表达；能够抑制Warburg效应。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
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本文编号：
2455705
