Rac1及IRAK1在肝癌细胞中对细胞凋亡和坏死性凋亡的影响

发布时间：2019-04-10 10:36

【摘要】：目的:通过抑制细胞的凋亡或坏死性凋亡途径,检测人肝癌细胞SK-Hep1和线粒体缺失的肝癌细胞P0SK-Hep1中Rac1及IRAK1蛋白表达的变化,从而探讨Rac1及IRAK1通过何种细胞死亡方式影响细胞的增殖与凋亡以及细胞线粒体缺失后对此的影响。方法:1、培养人肝癌细胞株SK-Hep1并建立线粒体DNA缺失的人肝癌细胞株P0SK-Hep1。2、分别用不同浓度特异性坏死性凋亡抑制剂Nec-1和广谱Caspase抑制剂z-VAD-FMK处理肝癌细胞SK-Hep1,使用MTS方法检测该药物对细胞的毒性作用,并选出合适的处理浓度。3、肝癌细胞SK-Hep1转染荧光标记的siRNA,通过荧光显微镜观察其转染效果,为后续的实验选出合适的转染条件,保证干扰实验达到较好的干扰效果。4、用Nec-1、z-VAD-FMK和Nec-1联合z-VAD-FMK分别处理肝癌细胞SK-Hep1,三个不同处理组再分别转染三种与凋亡或坏死性凋亡相关蛋白的小干扰RNA,转染进细胞后再提取细胞的总蛋白,最后运用western blot法检测干扰的目的蛋白和Rac1及IRAK1的蛋白表达变化。5、用Nec-1、z-VAD-FMK和Nec-1联合z-VAD-FMK分别处理线粒体DNA缺失的肝癌细胞P0SK-Hep1,三个不同处理组再分别转染三种与凋亡或坏死性凋亡相关蛋白的小干扰RNA,转染进细胞后再提取细胞的总蛋白,最后运用western blot法检测干扰的目的蛋白和Rac1及IRAK1的蛋白表达变化。结果:1、用不同浓度的特异性坏死性凋亡抑制剂Nec-1处理肝癌细胞SK-Hep1后,与DMS0组相比,30μM组的细胞存活率有明显差异(P0.05),而60μM组的细胞存活率高于90 μM组。2、用不同浓度的广谱Caspase抑制剂z-VAD-FMK处理肝癌细胞SK-Hep1后,与DMS0组相比,10 μM组的细胞存活率有明显差异(P0.05),而20 μM组的细胞存活率高于40 μM组。3、使用FAM-siRNA转染SK-Hep1肝癌细胞,在荧光显微镜下观察到转染后的肝癌细胞在蓝光的激发下可以看见有多数表达绿色荧光。4、在干扰RIP1的肝癌细胞SK和P0SK中,与空白组及阴性对照组相比,经过Nec-1、z-VAD-FMK及Nec-1联合z-VAD-FMK干预后三组细胞的Rac1蛋白表达量明显降低(P0.05);SK细胞中与空白组及阴性对照组相比,只有经过Nec-1联合z-VAD-FMK干预后细胞的IRAK1蛋白表达量明显上升(P0.05),P0SK细胞中三组实验组细胞的IRAK1蛋白表达量均未见明显差异(P0.05)。5、在干扰FADD的肝癌细胞SK和P0SK中,与空白组、阴性对照组及经Nec-1组相比,经过z-VAD-FMK及Nec-1联合z-VAD-FMK干预后细胞的Rac1蛋白表达量明显上升(P0.05)。SK细胞中与空白组及阴性对照组相比,只有经过Nec-1联合z-VAD-FMK干预后细胞的IRAK1蛋白表达量明显降低(P0.05),P0SK细胞中三组实验组细胞的IRAK1蛋白表达量均未见明显差异(P0.05)。6、在干扰TRAF6的肝癌细胞SK和P0SK中,与空白组、阴性对照组及经Nec-1组相比,经过z-VAD-FMK及Nec-1联合z-VAD-FMK干预后两组细胞的Rac1蛋白表达量明显降低(P0.05),而三组实验组细胞的IRAK1蛋白表达量均未见明显差异(P0.05)。结论:1、Rac1及IRAK1在人肝癌细胞株SK-Hep1和线粒体DNA缺失的人肝癌细胞株P0SK-Hep1中均有表达;2、Rac1及IRAK1促进肝癌细胞增殖,抑制细胞凋亡;3、Rac1主要是通过细胞凋亡的途径影响肝癌细胞的增殖与凋亡,与坏死性凋亡无关,而IRAK1主要影响细胞的凋亡和坏死性凋亡两种途径;4、在肝癌细胞中线粒体DNA的缺失对Rac1引起的细胞凋亡无明显作用,而对IRAK1引起的细胞凋亡或坏死性凋亡有影响。
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【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【参考文献】