人源化乳腺癌耐药蛋白高表达BCRP-MDCKⅡ细胞模型的建立IMMH002（H002）临床前药代动力学研究

发布时间：2019-04-12 07:26

【摘要】：Ⅰ人源化乳腺癌耐药蛋白高表达BCRP-MDCKⅡ细胞模型的建立乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP)的分子量约为72 kDa,属于ABC转运蛋白超家族。BCRP除了在肿瘤细胞中高表达介导多药耐药,也广泛存在于正常组织如肝脏、小肠、肾脏及某些特殊生理屏障如血脑屏障、胎盘屏障的毛细血管内皮细胞上。BCRP通过利用ATP水解释放的能量,将细胞内的有毒物质或者药物通过胃肠道、胆汁和尿液排出体外,发挥其抵抗外来毒性物质侵袭的作用。由于BCRP的外排作用能够影响药物的生物利用度、肝肾排泄率和组织分布,因此诱导或抑制BCRP的表达增加了体内药物-药物相互作用发生的潜在可能。这对于一些治疗指数小的药物如米托蒽醌、拓扑替康等尤其重要。对于治疗窗狭窄的药物而言,体内药物暴露量的微小波动可能引发临床疗效和毒性作用的显著变化,进而导致不良反应的发生。人源化BCRP高表达BCRP-MDCKⅡ细胞模型由于培养周期短,代与代之间均一性良好,常作为体外筛选BCRP底物和抑制剂的细胞模型,并可用于研究BCRP介导药物-药物相互作用(DDI)发生的可能性。本研究应用慢病毒感染MDCKⅡ细胞的方法建立人源化BCRP高表达BCRP-MDCKⅡ细胞模型。结果表明：1.酶切实验和DNA测序结果表明,携带目的基因ABCG2表达质粒pSIN4-EF2-ABCG2-IRES-Neo的菌种可在Soc培养基中正确扩增和富集。2.脂质体转染法介导pSIN4-EF2-ABCG2-IRES-Neo质粒进入病毒包装细胞HEK-293T,经G418筛选后,可得到含有目的基因BCRP的慢病毒。病毒滴度经测定为5×104 pfu/mL。3.慢病毒感染MDCKⅡ细胞,经G418筛选后,可得到人源化高表达BCRP-MDCKⅡ细胞模型。RT-PCR和western blot结果表明,BCRP-MDCKⅡ细胞株可稳定高表达外源基因ABCG2。Hoechest 33342外排实验和米托蒽醌双向转运实验结果表明两个底物在转染细胞中的外排率均较未转染细胞提高2倍以上,说明转染的BCRP功能良好,可作为体外筛选BCRP底物和抑制剂的细胞模型。综上所述,本研究应用慢病毒感染MDCKⅡ细胞的方法构建了人源化BCRP高表达BCRP-MDCKⅡ细胞模型,转染10代后仍可稳定高表达目的蛋白BCRP,为体外筛选BCRP底物和抑制剂及研究化合物和BCRP相互作用提供了可靠、实用的细胞模型。Ⅱ H002临床前药代动力学研究H002是一种新型鞘氨醇-1-磷酸受体1(Sphingosine 1-phosphate receptor subtype 1, S1PR1)激动剂。与传统免疫抑制剂(如糖皮质激素、环孢素A、他克莫司等)的作用机制不同,H002在体内可逆地生成其活性形式—磷酸化产物H002-P,通过与S1PR1结合使其发生内陷,诱导淋巴细胞“归巢”,抑制淋巴细胞自外周淋巴结及次级淋巴器官的外流,从而发挥免疫调控作用。前期药理研究表明,H002对类风湿性关节炎、实验性银屑病等免疫性疾病动物模型均有较好的药效。此外,H002诱导的外周血淋巴细胞数降低可在停药后短时间内恢复至正常水平,对机体正常免疫功能的影响较小。与已上市的S1PR1受体调节剂FTY720相比,H002作用于S1PR3的EC50 S1PR1的150倍[1],显著高于文献报道的FTY720对两个受体亚型的相对激活比值(3倍)[2],具有受体选择性高,引起心动过缓等不良反应的可能性较小的特点。本研究根据临床前药代动力学指导原则,建立了生物样品中H002及其代谢产物的LC-MS/MS分析方法,该方法简便、可靠、灵敏度高、特异性强,可满足H002的临床前药代动力学研究的需要。应用已建立的LC-MS/MS方法研究了大鼠和Beagle犬口服和静脉注射H002后的全血药代动力学、分布(大鼠)和排泄特征；鉴定了H002生物转化的主要场所和参与代谢的主要药酶类型；研究了H002与大鼠、犬、猴、人的血浆蛋白结合及其对CYP450s和UDPGT活性的影响,为揭示药物在体内的动态变化规律及种属差异,阐明药效作用的物质基础,了解药物在体内代谢、排泄特点以及预测潜在的药物相互作用提供试验依据。研究结果表明：1.生物样品中H002及其代谢产物测定方法(LC-MS/MS)的建立大鼠全血基质中,H002及其磷酸化产物H002-P、羟化产物H002-M分别在0.2-100 ng/mL、0.25-100 ng/mL和0.2-100 ng/mL浓度范围内线性关系良好,未见明显基质和杂质干扰。H002、H002-P和H002-M质控样品(浓度分别为0.5、 25、80 ng/mL,1.5、25、80 ng/mL,0.5、25、80 ng/mL,)的日内和日间精密度相对标准差均小于11.76%,准确度为±9.84%。低、中、高质控样品回收率为92.02-108.18%,基质效应为95.01-104.08%。质控样品在冰上放置6 h、处理后样品室温放置24 h、进样舱放置48 h、长期放置(-80℃放置7天、30天、3个月)和反复冻融3次等条件下均稳定。H002、H002-P和H002-M高浓度样品用大鼠空白全血稀释2、5、10、20倍后均不影响测定的准确性。Beagle犬全血基质中,H002及H002-P、H002-M分别在0.5-500 ng/mL、 0.25-100 ng/mL和0.5-100 ng/mL浓度范围内线性关系良好,全血中未见明显基质和杂质干扰。H002、H002-P和H002-M质控样品(1.5、75、400 ng/mL,0.6、 25、80 ng/mL,1.5、25、80 ng/mL,)的日内和日间精密度相对标准差均小于9.30%,低浓度的准确度在±18.00%范围内,中、高浓度的准确度在±14.80%范围内。低、中、高质控样品的回收率为106.78-112.49%,基质效应为97.45-104.42%。质控样品在冰上放置6 h、处理后样品室温放置24 h、进样舱放置48 h、长期放置(-80℃放置7天、30天、6个月)和反复冻融3次等条件下均稳定。H002、H002-P和H002-M高浓度样品用犬空白全血稀释5、10、20倍后均不影响测定的准确性。2.H002在大鼠体内的药代动力学研究(1)大鼠口服H002后的全血药代动力学雌雄大鼠口服H002(1、3、10、30 mg/kg)后5 min血中可检测到H002、H002-P和H002-M,给药后72-144h各组动物血药浓度低于或接近检测限。雄鼠口服H002 1、3、10、30 mg/kg后全血中原型药的Tmax分别为5.6、1.2、4.0、2.0h,Cmax分别为5.87、22.20、55.30、267.60 ng/mL, AUC(0-t)分别为93.16、125.79、630.27和3782.58 ng/mL×h, t1/2分别为9.12、13.42、10.41和18.37 h,MRT(0-t)分别为12.05、10.42、11.37和14.38 h；H002-P的Tmax分别为7.2、6.8、6.0、5.6 h,Cmax分别为24.02、45.76、161.22、567.20 ng/mL, AUC(0-t)分别为384.09、464.82、2348.96和10802.89 ng/mL×h, t1/2分别为8.14、12.43、12.65和16.00 h,MRT(0-t)分别为14.75、12.34、13.72和16.33 h；H002-M的Tmax分别为7.2、4.8、6.8、6.0h,Cmax分别为5.40、13.06、33.50、114.46 ng/mL,AUC(0-t)分别为82.35、127.40、427.18和2213.58 ng/mL×h, t1/2分别为8.74、5.95、7.07和16.62 h,MRT(0-t)分别为11.80、9.94、11.26和15.98 h。雌鼠口服H0021、3、10、30 mg/kg后全血中原型药的Tmax分别为4.0、2.5、4.8、1.3 h,Cmax分别为7.74、21.38、69.50、435.4 ng/mL, AUC(0-t)分别为104.63、192.08、987.84和5526.58 ng/mL×h, t1/2分别为5.04、16.21、11.57和15.02 h,MRT(0-t)分别为10.72、11.42、11.39和20.58 h；H002-P的Tmax分别为8.8、6.4、6.4、4.0 h,Cmax分别为28.68、56.08、235.00,770.60 ng/mL, AUC(0-t)分别为461.73、705.88、3723.55和16612.94 ng/mL×h, t1/2分别为9.74、12.31、13.42和17.13 h,MRT(0-t)分别为13.26、13.19、13.53和22.43 h：H002-M的Tmax分别为7.2、5.2、5.6、10.4 h,Cmax分别为4.62、12.28、31.82、79.60 ng/mL, AUC(0-t)分别为65.90、130.42、472.68和2059.02 ng/mL×h, t1/2分别为8.75、7.22、7.91和15.43 h,MRT(0-t)分别为11.46、10.73、11.40和24.26 h。雌雄大鼠口服H002后,H002、H002-P和H002-M的Cmax和AUC(0-t)随剂量增加而递增,在1-30 mg/kg剂量范围内原型药、H002-P和H002-M在体内基本呈线性动力学过程,高剂量组t1/2和MRT(0-t)随剂量增加略有延长。各剂量组H002-P的Cmax和AUC(0-t)均大于原型药和H002-M。雌鼠口服H002后原型药和H002-P的AUC(0-t)略高于雄鼠,H002-M无明显性别差异。(2)大鼠静脉注射H002后的全血药代动力学雌雄大鼠静脉注射H002后2 min血中可检测到原型药及代谢物H002-P和H002-M,给药后48h各组动物血药浓度低于或接近检测限。雌、雄大鼠给药后2min原型药的平均血药浓度分别为348.6和304 ng/mL, AUC(0-t)分别为187.85和141.3 ng/mL×h,t1/2分别为7.73和7.43 h,MRT(0-t)分别为6.71和5.83 h；代谢物H002-P的Tmax分别为0.93和0.41 h,Cmax分别为41.72和47.12 ng/mL,AUC(0-t)分别为399.49和299.88 ng/mL×h, t1/2分别为7.47和6.95h,MRT(0-t)分别为9.56和8.37 h；代谢物H002-M的Tmax分别为0.69和0.10h, Cmax分别为6.71和7.69 ng/mL, AUC(0-t)分别为57.29和43.56 ng/mL×h, t1/2分别为9.7和10.33 h,MRT(0-t)分别为11.54和11.37h。雌、雄大鼠口服H002(3 mg/kg)后原型药的生物利用度分别为9.62%和8.90%(H002-P相当于等剂量静脉给药的17.91%和15.66%)。(3)大鼠口服11002后在体内主要组织的分布大鼠口服H002(1 mg/kg)后原型药和代谢物在体内分布广泛。雄鼠给药后0.5 h组织和器官中原型药浓度排序为：胃小肠淋巴结肾上腺肺肝脏肾骨髓脂肪脾肌肉附睾心脏胸腺睾丸全血,脑中药物浓度低于最低定量限。雌鼠给药后0.5 h组织和器官中原型药浓度排序为：淋巴结胃小肠肾上腺肺子宫心脏卵巢肝脏肾骨髓脂肪脾肌肉胸腺脑全血。雌雄给药后4 h、18 h的分布趋势与0.5 h相似。H002-P和H002-M在各组织中的分布趋势和原型药相似。大鼠口服H002后在胃肠道及血流量丰富组织的分布较多。多数组织中的药物浓度高于同时间点血药浓度。雌雄大鼠的组织分布趋势基本相似,无明显性别差异。(4)大鼠口服H002后自粪、尿、胆汁中的排泄雌雄大鼠口服H002后在粪、尿、胆汁中均可检测到原型药、H002-P、H002-M和羟化产物的硫酸结合物(H002-OSO3)。雄雌大鼠口服H002(1 mg/kg)后胆汁中原型药、H002-M、H002-OSO3(校正定量)、H002-P的累积排泄量分别为给药量的0.007%、0.375%、4.826%、0.008%和0.011%、0.642%、5.796%、0.060%。雄雌大鼠给药后72 h胆汁中原型药和代谢物的累积排泄量分别约为给药量的5.216%和6.509%。雄雌大鼠口服H002 (1 mg/kg)后粪便中原型药、H002-M、H002-OSO3(校正定量)、H002-P的累积排泄量分别为给药量的2.353%、15.233%、33.114%、0.047%和1.627%、12.825%、20.569%、0.052%,雄雌大鼠给药后6 d粪便中原型药和代谢物的累积排泄量分别约为给药量的50.747%和35.073%。雄雌大鼠口服H002(1 mg/kg)后尿液中原型药、H002-M、H002-OSO3(校正定量)、H002-P的累积排泄量分别为给药量的0.049%、5.576%、0.630%、0.010%和0.012%、7.197%、0.666%、0.005%,雄雌大鼠给药后6 d尿液中原型药和代谢物的累积排泄量分别约为给药量的6.265%和7.880%。雄雌大鼠口服H002(1 mg/kg)后原型药和代谢物粪、尿总排泄量分别为给药量的57.01%和42.95%,主要经粪便途径。(5)H002与大鼠、犬、猴和人的血浆蛋白的结合H002(30、300和1500 ng/mL)与大鼠、犬、猴和人的血浆蛋白结合率为98.13-99.17%,提示H002与血浆蛋白高度结合,各种属间无明显差异,也未见明显浓度依赖性。3.H002在Beagle犬体内的药代动力学研究(1) Beagle犬口服H002后的全血药代动力学Beagle犬口服H002 0.3、1.8、10 mg/kg后5-30 min血中可检测到原型药、H002-P和H002-M(0.3mg/kg剂量组多数时间点H002-M的浓度均低于最低定量限),血药浓度呈多峰现象,给药后384-1248 h各组动物血药浓度低于或接近检测限。雌犬口服0.3、1.8、10 mg/kg H002后全血中原型药的Tmax分别为19.75、6.50、5.50 h,Cmax分别为28.45、276.25、1562.5 ng/mL, AUC(0-t)分别为2951.13、28030.93和291344.91 ng/mL×h, t1/2为82.95、97.63和160.88 h,MRT(0-t)分别为111.24、119.75和233.38 h；H002-P的Tmax分别为19.50、21.00、34.50 h,Cmax分别为2.48、11.67、90.88 ng/mL, AUC(0-t)分别为401.53、1460.88和19964.51 ng/mL×h,t1/2分别为136.23、89.91和143.52 h,MRT(0-t)分别为146.70、112.51和237.31 h；中高剂量组H002-M的Tmax分别为16.00和19.00 h,Cmax分别为5.74和44.35 ng/mL, AUC(0-t)分别为471.12和4877.23 ng/mL×h, t1/2分别为148.63和125.44 h,MRT(0-t)分别为81.55和158.08 h。雄犬口服0.3、1.8、10 mg/kg H002后全血中原型药的Tmax分别为11.00、4.25、5.00 h,Cmax分别为27.38、283.5、1685.00 ng/mL, AUC(0-t)分别为1347.83、22169.09和108385.97 ng/mL×h,t1/2分别为46.71、89.83和168.56 h,MRT(0-t)分别为72.80、98.46和170.17 h；H002-P的Tmax分别为15.00、18.00、19.50 h,Cmax分别为1.72、10.09、93.20 ng/mL, AUC(0-t)分别为202.87、1092.17和10254.62 ng/mL×h, t1/2分别为106.53、68.50和111.27 h,MRT(0-t)分别为91.57、90.62和142.82 h；中高剂量组H002-M的Tmax分别为18.00和20.00 h,Cmax分别为9.74和55.48 ng/mL AUC(0-t)分别为518.04和4799.64 ng/mL×h, t1/2分别为82.66和93.08 h,MRT(0-t)分别为120.57和117.51 h。雌雄Beagle犬口服H002后,原型药和代谢物的Cmax和AUC(0-t)随给药剂量增加而递增,在0.3～10 mg/kg剂量范围内原型药及代谢物在体内基本呈线性动力学过程,高剂量组t1/2和MRT0-t¨随剂量增加略有延长。各剂量组原型药的Cmax和AUC(0-t)均高于H002-P和H002-M。血中原型药和H002-P的Cmax未见明显性别差异,但雌犬的AUC(0-t)略高于雄犬,t1/2和MRT(0-t)也有所延长,但无统计学差异；H002-M的的药代动力学参数未见明显性别差异。(2) Beagle犬静脉注射H002后的全血药代动力学雌雄Beagle犬静脉注射H002 (0.1 mg/kg)后2 min血中可检测到原型药和代谢物H002-P,多数时间点血样中代谢物H002-M的含量低于最低定量限(0.5 ng/ml)。原型药和H002-P的血药浓度于给药后22 d和16 d低于或接近检测限。雌、雄犬给药2 min后全血中原型药平均浓度分别为152.50和155.00 ng/mL, AUC(0-t)分别为3352.71和2238.90 ng/mL×h, t1/2分别为111.91和62.92 h,MRT(0-t)分别为85.04和63.29 h；代谢物H002-P的Cmax分别为1.13和1.23 ng/mL,AUC(0-t)分别为159.02和103.02 ng/mL×h,t1/2分别为102.99和73.45 h,MRT(0-t)分别为110.67和61.80 h。雌雄Beagle犬口服H002 1.8 mg/kg后原型药的生物利用度分别为46.4%和55.0%(H002-P分别相当于等剂量静脉给药的51.05%和58.90%)。(3) Beagle犬多次口服H002后的全血药代动力学Beagle犬连续口服H002 (1.8 mg/kg)12天后血药浓度达到稳态,末次给药后雌雄犬血中原型药、H002-P和H002-M的药代动力学参数未见明显性别差异。与单次给药相比,末次给药后(24 h)原型药和代谢物的Cmax和AUC(0-t)均明显增加。雌犬原型药、H002-P、H002-M的Cmax增加倍数分别为3.06、3.14和4.24倍,AUC(0-t)增加倍数分别为3.31、3.78和4.93倍；雄犬原型药、H002-P、H002-M的Cmax增加倍数分别为2.91、3.23和3.42倍,AUC(0-t)增加倍数分别为3.03、3.30和3.68倍,提示Beagele犬多次口服H002后原型药和代谢物在体内有蓄积倾向。(4) Beagle犬口服H002后自粪、尿中的排泄Beagle犬口服H002后粪、尿中均可检测到原型药、H002-P、H002-M及H002-OS03。雌雄Beagle犬口服H002(1.8mg/kg)后原型药、H002-M、H002-OSO3(校正定量)和H002-P经粪的累积排泄量分别为给药量的15.622%、5.945%、74.912%、0.269%和16.797%、5.733%、73.872%、0.250%,雌雄Beagle犬粪中原型药和代谢物的累积排泄量分别约为给药量的96.748%和96.652%。雌雄Beagle犬口服H002 (1.8 mg/kg)后原型药、H002-M、H002-OSO3(校正定量)和H002-P经尿的累积排泄量分别为给药量的0.549%、2.494%、1.499%、0.005%和0.476%、2.671%、2.140%、0.005%,原型药和代谢物在雌雄Beagle犬尿中的累积排泄量分别约为给药量的4.547%和5.292%。雌雄Beagle犬口服H002 (1.8 mg/kg)后30天内原型药和代谢物粪、尿总排泄量分别为给药量的101.30%和101.94%,主要经粪排泄。4.H002的生物转化研究大鼠、Beagle犬口服H002后在血、粪、尿、胆汁中可检测到多个代谢产物,包括磷酸化产物(H002-P)、羟化产物(H002-M)、羟化产物的硫酸结合物(H002-OSO3)。H002与大鼠/人/犬/猴肝微粒体体外温孵后也可检测到代谢物H002-P和H002-M,体内外代谢产物具有一定的相关性,而H002-OSO3主要在体内生成。体外代谢稳定性研究结果表明,H002 (10μM)与人工胃液、人工肠液、肠道菌群及大鼠血浆温孵6 h后未见明显减少。与大鼠、犬、猴、人全血温孵6 h后H002-P的生成量随温孵时间延长逐渐增加,提示全血可能是H002-P生成的主要场所。H002与大鼠不同组织匀浆温孵后,H002-P的生成量依次排序为血肝脏脾脏脑胃淋巴结心脏肾肺小肠胸腺,H002-M生成量的排序为肝脏小肠肺脾淋巴结肾脑胸腺心脏胃,进一步提示H002-P生成的主要场所为全血,H002-M生成的主要场所为肝脏和小肠。H002与大鼠、犬、猴、人红细胞温孵结果表明,红细胞是H002-P生成的重要场所,生成速率依次为大鼠猴人犬,SPHK1的选择性抑制剂CB5468139、SPHK1和SPHK2的双重抑制剂DMS、SPHK2的竞争性抑制剂FTY720可不同程度地抑制H002-P的生成,提示SPHK1及SPHK2均可能参与H002-P在红细胞中的生成。体外肝微粒体温孵实验结果表明,H002在大鼠、犬和人肝微粒中的氧化代谢物除H002-M外,还可检测到另一个羟化产物H002-M1,而猴肝微粒体中H002的氧化代谢物主要为H002-M1。应用CYP450同工酶的选择性抑制剂、抗体和14个人源化重组酶的研究结果表明,CYP1A1、CYP2J2、CYP3A4、CYP4F2主要参与H002-M的生成,CYP1A2、CYP2D6、CYP4F12等也有少量参与。参与H002-M1生成的同工酶主要为CYP2J2、CYP4F2、CYP4F3B,以上结果提示H002的氧化代谢是多酶参与的转化过程。5.H002及其代谢产物对药物代谢酶的抑制/诱导作用H002体外(1-10 μM)对大鼠/人/犬/猴肝微粒体中的CYP1A2、CYP2C19、 CYP4F2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2J2、CYP2E1的抑制作用为20.16%-40.33%,H002-P (1-10 μM)对以上4个种属肝微粒体CYP1A2、CYP2C19、CYP2E1、 CYP2J2、CYP2C9、CYP4F2的抑制作用为26.10%-43.17%,H002-M对以上4个种属肝微粒体CYP1A2、CYP2C19、CYP2E1、CYP2J2、CYP4F2、CYP2C9的抑制作用为21.07%-56.69%,上述抑制作用明显弱于阳性抑制剂,且浓度高于本研究中大鼠、犬所用最高剂量的Cmax。H002对肝微粒体CYP2D6、CYP3A4无明显影响。雄鼠多次口服H002 (3 mg/kg/d×7d)后肝微粒体CYP2E1、CYP2J3/4活性轻度降低(21.1%-33.3%)；雌鼠CYP1A2、CYP2C11、CYP2C6酶活性轻度升高(20.1%-44.1%),CYP4F1略有降低(21.2%)。H002对雄鼠的GST有轻度诱导作用,对UDPGT有轻度抑制作用,但对雌鼠GST和UDPGT均无明显影响。6.H002在Caco-2和MDR1-MDCKII细胞中的转运H002在Caco-2和MDR1-MDCKII细胞中的转运具有明显的方向性,当加入P-糖蛋白抑制剂PSC833后方向性消失,提示H002可能是P-gp的底物。MDR1-MDCKII细胞中H002对P-gp介导的地高辛转运活性具有一定的抑制作用,IC50为0.29 μM。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
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本文编号：2456828