miR-181a-5p通过下调基质金属蛋白酶-14抑制恶性肿瘤的细胞迁移和血管生成

发布时间：2019-05-08 10:21

【摘要】：背景与目的转移,即恶性肿瘤细胞从原发部位到远隔脏器的播散,其导致了90%的人类恶性肿瘤相关性死亡。从病理上讲,转移是一个包含了一系列离散生物学事件的多步骤过程。在该过程中,恶性肿瘤细胞的侵袭是最为关键的生物学步骤之一,它参与了从转移起始发生到形成继发肿瘤的转移相关性级联反应中的几乎每一个阶段。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)是一类包含25个高度同源性家族成员的钙离子依赖性含锌肽链内切酶。传统认为,基质金属蛋白酶的主要功能是对细胞间粘附分子以及细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)进行降解,从而为恶性肿瘤细胞的侵袭浸润提供有利条件。最近,基质金属蛋白酶又被证实具有独立于其蛋白水解活性之外的增强细胞迁移能力的功能。基质金属蛋白酶-14(Matrix metalloproteinase-14, MMP-14)是一种膜嵌入型基质金属蛋白酶,它能够通过降解细胞外基质以及基底膜蛋白、激活MMP-2前体以及MMP-13前体、诱导生长因子激活、增强细胞迁移能力,从而在恶性肿瘤侵袭转移中扮演十分关键的角色。在表型上,MMP-14对于促进上皮细胞向可迁移的间充质样细胞转化(Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)也发挥了至关重要的作用,该转化被认为是转移过程起始步骤的一个重要机制。然而,MMP-14在恶性肿瘤进展过程中的表达调控机制仍然有待进一步阐明。研究证实,转录因子Spl和Egr-1能够上调MMP-14的表达水平。MMP-14还被证实能在转录水平上受到乏氧诱导因子-2α(Hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α)的调节。MMP-14表达水平不但受到这些转录因子的正性调控,它还受到miRNA-9和miRNA-133a等microRNAs(miRNAs,miR)的负性调控。microRNAs(miRNAs或miR)为高度保守的非编码小RNA,其被报道能够通过转录后抑制、信使RNA降解或启动子激活,负性或正性地调节转移相关基因表达从而参与转移过程。尽管miRNAs能够通过与所调节基因的启动子区域结合正性调节基因表达,但绝大多数niRNAs均被报道可抑制翻译或通过与靶信使RNA的3'端非翻译区(Three prime untranslated regions,3'UTR)相互作用诱导其发生序列特异性降解从而负性调节靶基因的表达。miRNAs首先被转录成大约70个核苷酸的前体,然后经过名为Dicer的核糖核酸酶-Ⅲ型酶(Nase-III type enzyme)处理,得到约为22个核苷酸的成熟产物。迄今为止,人类基因组已被鉴定出含有超过1500个niRNAs编码基因,它们共同调控着大约30%的人类基因表达。与此同时,每个独立的miRNA也被证实能够调控数十至数百个基因的表达,从而对多种细胞通路进行高效的协调与整合。有趣的是,许多miRNAs以多成员家族的形式存在,表明了它们功能上的冗余。miR-181a-5p为miR-181s的家族成员,该家族包括了4个高度保守的成熟miRNA分子,分别为miR-18la、miR-181b、miR-181c和miR-181d.它们独立来自6个miRNA前体,这些miRNA前体的编码基因位于3条不同的染色体上。最近,这组新的基因被证实能在恶性转化过程中发挥关键作用。另一方面,miR-181s家族成员也在许多肿瘤中表达下调从而发挥肿瘤抑制基因的功能。在本研究中,我们证实了miR-181a-5p能够通过直接靶定MMP-14信使RNA的3'UTR从而负性调节MMP-14表达,造成细胞迁移能力、侵袭能力以及血管生成能力的显著降低。我们的数据突出了miR-181a-5p在恶性肿瘤播散过程中的重要功能性角色,揭示了一个具有预后意义的潜在生物标志物以及预防恶性肿瘤转移的潜在分子靶点。材料与方法在第一部分的研究中,我们采用基因芯片数据库数据挖掘技术、激光捕获显微切割技术、Real time PCR和免疫组织化学染色方法,对MMP-14在来自不同器官的不同恶性肿瘤中的表达水平以及MMP-14在恶性肿瘤组织(包括浸润前缘的恶性肿瘤细胞)和癌旁正常组织中的表达情况进行了系统的检测与分析,验证了MMP-14在多种人类恶性肿瘤中的表达上调情况,阐明了MMP-14表达分布与恶性肿瘤细胞侵袭浸润状态之间的相关性。在第二部分的研究中,我们采用生物信息学分析、DNA构建体构建、慢病毒系统、Real time PCR、蛋白免疫印迹和双荧光素酶实验的方法,对MMP-14的潜在调节者进行了预测,证实了niR-181a-5p能够干扰异位表达的MMP-14,且能够通过直接靶定MMP-14信使RNA的3'UTR从而对MMP-14的表达发挥负性调节作用。在第三部分的研究中,我们采用DNA构建体构建、慢病毒系统、明胶酶谱分析、蛋白免疫印迹、Transwell小室细胞迁移实验、基于圆点的2D细胞迁移实验、基于圆点的3D细胞侵袭实验、大体手工刮取技术、Real time PCR,细胞表面生物素酰化实验、鸡胚绒毛尿囊膜侵袭实验和鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验的方法,探索了miR-181a-5p对MMP-14功能的影响,证实了miR-181a-5p能够抑制MMP-14介导的细胞迁移、细胞侵袭以及血管生成。结果1.MMP-14在多种人类恶性肿瘤中表达上调人类恶性肿瘤细胞中表达上调的MMP-14已被证实能够促进肿瘤的生长和转移。尽管MMP-14在多种恶性肿瘤中均被报道为表达上调,但迄今为止仍然没有关于MMP-14在来自不同器官的不同恶性肿瘤中表达水平的系统分析。通过挖掘基因芯片数据库Oncomine (癌症分析数据库),我们评估了MMP-14在人类恶性肿瘤标本中的表达水平。当P值被赋值限定在小于0.01时,相较于各自的非恶性对照组织,大量的恶性肿瘤展现出了MMP-14的显著表达上调。为了验证数据挖掘结果,我们检测了MMP-14在人类乳腺癌标本中信使RNA与蛋白的表达水平。我们采用本课题组既往使用的激光捕获显微切割技术采集了乳腺癌细胞和癌旁正常上皮细胞,然后行Real time PCR检测其中的MMP-14信使RNA水平。我们的数据表明,MMP-14选择性地表达于人类乳腺导管原位癌和浸润性导管癌中,而正常上皮则未见表达。MMP-14在浸润性导管癌中的表达水平高于其在乳腺导管原位癌中的表达水平,尽管两者之间的差别没有统计学意义。为了确认这个现象,我们使用抗-MMP-14抗体对相应的人类乳腺癌标本进行了免疫组织化学染色。与Real time PCR的检测数据相一致,MMP-14蛋白仅在人类乳腺癌细胞中被检测到,而并未在邻近的正常上皮细胞中被检测出来。为了进一步证实我们数据挖掘结果所显示的MMP-14表达上调是一个恶性肿瘤中的普遍现象,我们使用抗-MMP-14抗体对人类结肠癌标本进行了免疫组织化学染色。我们观察到MMP-14在正常结肠粘膜细胞中表达量极少,而在位于浸润前缘的恶性肿瘤细胞中却呈现了显著升高的染色强度。因此,我们的研究表明,MMP-14在人类恶性肿瘤中显著表达上调,且其表达水平与恶性肿瘤的侵袭浸润状态密切相关。2. miR-181s被计算机预测为MMP-14的潜在调节者MMP-14在人类恶性肿瘤中呈现显著表达上调,然而其表达上调的调节机制仍然有待进一步阐明。当我们将包含有MMP-143'UTR的MMP14-GFP嵌合体cDNA (MMP14-GFP/3'-UTR)瞬时转染至低侵袭性人类乳腺癌细胞MCF-7和高侵袭性人类乳腺癌细胞MDA-MB-231时,我们注意到MMP 14-GFP在MCF-7细胞中的表达弱于在MDA-MB-231细胞中的表达。然而这种差异并没有在瞬时转染了不包含MMP-14 3'UTR的MMP14-GFP嵌合体cDNA的细胞中被观察到。这个结果也可在人类前列腺癌细胞LNCaP(低侵袭性)、DU145和PC3(高侵袭性)中被重复出来,提示MMP-14信使RNA 3'UTR可能含有造成MMP-14在不同恶性肿瘤细胞系中差异表达的调控序列。众所周知,3'UTR通常包含miRNA应答元件(miRNA response elements, MRE),这些元件正是rniRNAs能够与3'UTR相结合的序列。为了识别MMP-14信使RNA 3'UTR上假定的miRNA应答元件,我们使用TargetScan搜寻其中潜在的miRNA应答元件。该分析显示,MMP-14信使RNA 3'UTR上存在多个miRNA应答元件能够潜在地与miR-22、miR-24、miR-26、miR-133、miR-150以及miR-181s相互作用。为了增加这些假定的niRNA应答元件存在于3'UTR上的概率,我们又使用了另一个miRNA预测算法miRanda.通过对TargetScan和miRanda所预测的miRNA应答元件进行对比分析,我们发现只有miR-133和miR-181s是同时被两种计算机分析方法预测出来的共同结果。而在该3'UTR的第291个核苷酸至第297个核苷酸之间,niR-181的miRNA应答元件与miR-181 s相结合的预测得分最高,因此我们选择了对miR-181s进行进一步研究。3.miR-181a-5p能够干扰异位表达的MMP-14由于不同亚型的miR-181包含了可与MMP-14 3'UTR结合的相同种子序列,miR-181a-2连同其两侧含有140个碱基对的侧翼区被我们从染色体DNA中扩增了出来,所获得的DNA也被我们克隆至包含绿色荧光蛋白报告基因的MDH1-PGK-GFP 20逆转录病毒载体中。基于当下的miRNA命名原则(http://www.mirbase.org), 我们将包含hsa-miR-181a-2成熟序列的载体命名为miR-181a-5p/GFP。采用相似的方法,被预测为不能与MMP-143'UTR相结合的miR-128也被我们克隆至MDH1-PGK-GFP 2.0逆转录病毒载体中作为对照(miR-128/GFP)。我们通过瞬时转染编码miR-181a-5p/GFP的cDNAs和对照载体至不表达可检测到的内源性MMP-14的COS-1细胞中,使miR-181a-5p在该细胞中异位表达。采用Real time PCR方法,我们检测到成熟的miR-181a-5p和miR-128已在瞬时转染的COS-1细胞中表达,且与对照载体相比,miR-181a-5p和miR-128的表达水平分别达到了5倍和7倍的升高,表明成熟的miR-181a-5p和miR-128已在受转染细胞中被高效地生产。随后, 我们将MMP-14/3'-UTR和miR-control、miR-81a-5p/GFP或miR-128/GFP分别共转染至COS-1细胞中,检测miR-181a-5p能否影响异位表达的MMP-14。为了增加miRNA和MMP-14/3'-UTR的表达效率,我们首先在COS-1细胞中稳定表达各个miRNA,然后再瞬时转染MMP-14/3'-UTR cDNAs和对照载体。异位表达的miR-181a-5p,而非miR-control或miR-128,导致了MMP-14信使RNA水平和蛋白水平的显著降低,提示miR-181a-5p能够下调MMP-14的信使RNA。为了进一步阐明miR-1 81 a-5p所致的MMP-14信使RNA水平和蛋白水平表达缺失是由于MMP-14 3'-UTR的存在,我们采用过去已合成的仅编码MMP-14开放阅读框架但缺少MMP-143'UTR的质粒DNA对COS-1细胞进行瞬时转染。蛋白免疫印迹显示,在过度表达miR-181 a-5p或miR-control的细胞中,MMP-14的异位表达水平并无显著性差异,从而证实了MMP-143'UTR中miR-181应答元件的存在。为了进一步验证miR-181a-5p对调节MMP-14表达水平的作用,我们合成了U6启动子驱动的miRNA海绵以下调miR-181a-5p的表达。相较于对照海绵,当miR-181 a-5p海绵在表达高水平内源性miR-181a-5p的MCF-7细胞中稳定表达时,我们发现它能高效地降低细胞中的miR-181a-5p表达水平。为了阐明miRNA海绵介导的内源性miR-181a-5p减少是否能够导致MMP-14的表达水平升高,我们对内源性表达和异位表达的MMP-14进行了检测。已有研究证实,乏氧环境能够诱导MMP-14表达上调。当稳定表达miRNA海绵的MCF-7细胞被置于乏氧环境下培养48小时后,相较于表达对照海绵的细胞,内源性MMP-14在表达miR-181a-5 p海绵的细胞中被观察到显著上调。为了进一步验证miR-181a-5p在调节MMP-14表达中的作用,我们检测了miR-181a-5p对异位表达MMP-14的影响。我们使用MMP 14-GFP/3'-UTR对稳定表达miRNA海绵的MCF-7细胞进行瞬时转染,然后分析MMP14-GFP的信使RNA表达和蛋白表达。异位表达的miR-181a-5p海绵,而非miR-control海绵,导致了MMP14-GFP信使RNA水平和蛋白水平的显著上调,进一步提示了MMP-14可被miR-181a-5p负性调节。4.miR-181 a-5p与MMP-143'-UTR的直接相互作用为了证实miR-181a-5p能够直接靶定MMP-14 3'-UTR,我们将包含有预测的miR-181a-5p应答元件的MMP-14 3'UTR序列融合到了荧光素酶报告基因中(Luc/3'-UTR).使用定点突变方法,我们又将预测的miR-181a-5p应答元件(7个核苷酸)转换成互补序列作为对照,以排除miR-181 a-5p的潜在结合(Luc/3'-UTRmu).miR-181a-5 p的表达显著减少了Luc/3'-UTR的荧光素酶活性,而在表达miR-control或Luc/3'-UTRmu的细胞中则没有观察到这个现象。当报告基因Luc/3'-UTR被转染至稳定表达miR-181a-5p海绵的MCF-7细胞时,其荧光素酶活性相较于稳定表达miR-control的细胞呈现显著升高,而Luc/3'-UTRmu的荧光素酶活性则并没有被miR-181a-5p所影响。因此,我们所观察到的miR-181a-5p诱导的MMP-14表达下调直接依赖于MMP-14信使RNA 3'UTR上的一个单一同源识别位点。采用基于图像的实验研究方法,我们观察到共表达MMP 14-GFP/3'UTR和miR-181a-5p(无GFP)的COS-1细胞相较于共表达MMP 14-GFP/3'UTR和miR-control(无GFP)的对照细胞,其荧光强度呈现显者降低。相反地,相较于稳定表达对照海绵的MCF-7细胞,MMP 14-GFP/3'-UTR的荧光强度在稳定表达miR-181a-5p海绵的MCF-7细胞中呈现显著升高。5.miR-181a-5p对功能性MMP-14的影响我们过去曾经报道,功能性MMP-14能够增强蛋白水解活性和细胞迁移能力。MMP-2是一种分泌性的基质金属蛋白酶,能够促进恶性肿瘤的侵袭和转移,且一直被视为功能性MMP-14的指示器。因此我们随后检测了miR-181a-5p诱导的MMP-14表达量减少是否会导致MMP-2活性和细胞迁移能力的降低。相较于表达MMP-14/3'-UTR和miR-control或miR-128的对照细胞,将MMP-14/3'-UTR和miR-181a-5p/GFP共转染至COS-1细胞后能够导致MMP-2前体的激活减少,这种激活减少可通过MMP-2中间产物和完全激活状态MMP-2的减少以及伴随的MMP-2前体增多来证明,且与MMP-14的表达水平降低密切相关。考虑到TIMP-2是MMP-14的天然抑制剂,因此我们检测了miR-181a-5p诱导的MMP-14功能降低是否由于TIMP-2上调所致。然而我们的蛋白免疫印迹结果排除了这种可能性,因为miR-181a-5p并没有增强TIMP-2在MDA-MB-231细胞中的表达。与MMP-2的活性降低相一致,miR-181 a-5p/GFP和MMP-14/3'-UTR在COS-1细胞中的异位表达导致了细胞迁移能力的显著降低。重要的是,miR-128未能在表达MMP-14/3'-UTR的COS-1细胞中抑制细胞迁移能力,提示miR-181a-5p是调控MMP-14表达的一个关键因素,这种MMP-14的表达下调能够导致蛋白水解潜能和细胞迁移能力的显著降低。6.人类恶性肿瘤细胞系和人类恶性肿瘤标本中miR-181a-5p与MMP-14表达水平的负性相关已有研究证实,MMP-14的表达上调可在侵袭性人类恶性肿瘤中被观察到,且与人类恶性肿瘤细胞系的侵袭能力密切相关。为了探索内源性miR-181a-5p水平与MMP-14表达在人类恶性肿瘤细胞系中的相关性,我们采用Real time PCR和蛋白免疫印记方法对人类恶性肿瘤细胞系进行了研究。如我们所料,MMP-14在高侵袭性恶性肿瘤细胞系中呈现相对较高的表达水平,例如HT1080细胞、MDA-MB-231细胞和乳腺癌干细胞SK-3rd。有趣的是,相较于低侵袭性恶性肿瘤细胞系,例如MCF-7细胞和SK-BR3细胞,miR-181a-5p在高侵袭性恶性肿瘤细胞系中的表达则呈现为显著降低。为了阐明该现象的临床意义,我们又检测了miR-181a-5p和MMP-14表达水平在人类恶性肿瘤标本中的相关性。由于MMP-14在正常结肠粘膜中的表达水平极低,但在位于浸润前缘的恶性肿瘤细胞中能够呈现显著升高的染色强度,因此我们采用大体手工刮取技术,收集了人类结肠癌样本中位于浸润前缘的肿瘤细胞和癌旁正常上皮细胞,然后行Real time PCR检测miR-181a-5p的表达水平。与在细胞系中观察到的结果一致,相较于癌旁正常上皮细胞,miR-181a-5p在侵袭性恶性肿瘤细胞中呈现显著表达降低。这些数据表明,MMP-14在侵袭性人类恶性肿瘤中的表达可被miR-181a-5p的表达水平所影响。为了进一步阐明miR-181a-5p与MMP-14表达水平在恶性肿瘤进展中的因果关系,我们使用MDA-MB-231细胞进行研究,因为相较于其他恶性肿瘤细胞系,该细胞系具有高侵袭性且表达较高水平的MMP-14。当MDA-MB-231细胞被瞬时转染miR-181a-5p/GFP后,其内源性MMP-14表达在信使RNA水平和蛋白水平均呈显著降低。这种相关性同样也在高表达内源性MMP-14的HT1080细胞中被重复了出来。MMP-14表达水平的特异性下调被证实能够显著抑制恶性肿瘤细胞的迁移能力和侵袭能力,即使其他的基质金属蛋白酶仍在持续表达。因此,我们不禁要问miR-181a-5p是否能够影响恶性肿瘤细胞的细胞迁移能力。通过Transwell/(?)室细胞迁移实验,我们发现在MDA-MB-231细胞中过度表达miR-181a-5p能够导致该细胞的迁移能力显著降低。而miR-181a-5p所致的细胞迁移能力降低也在异位表达miR-181a-5p的HT1080细胞中被进一步证实。由于细胞迁移是恶性肿瘤侵袭过程中至关重要的决定性步骤,因此我们采用了3D细胞侵袭实验以阐明MDA-MB-231细胞和HT1080细胞中过度表达的miR-181a-5p是否能够抑制细胞的侵袭能力。如我们所料,当miR-181a-5p过度表达时,两种细胞的细胞侵袭能力均呈现为显著降低。由于MMP-14为跨膜蛋白酶,因此我们接下来要探讨niR-181a-5p诱导的恶性肿瘤细胞迁移能力和侵袭能力的降低是否为细胞表面的MMP-14丢失所致。通过细胞表面生物素酰化实验,我们发现在异位表达高水平2miR-181a-5p勺HT1080细胞中,细胞表面的MMP-14相较于对照细胞呈现显著降低。7.过度表达miR-181a-5p能够降低恶性肿瘤细胞的体内侵袭能力和血管生成能力MMP-14的表达与恶性肿瘤侵袭能力的增强常常互为相关。为了直接检测miR-181a-5p是否能够抑制MMP-14介导的恶性肿瘤细胞穿透基底膜的体内侵袭能力,我们进行了鸡胚绒毛尿囊膜(Chick chorioallantoic membrane, CAM)侵袭实验。鸡胚绒毛尿囊膜包含了绒毛膜上皮和下层的主要由IV型胶原构成的尿囊膜,该尿囊膜能够模拟人类上皮细胞的基底膜。恶性肿瘤细胞穿透表层的鸡胚绒毛尿囊膜的上皮细胞和基底膜进入结缔组织的侵袭现象,可经苏木素-伊红染色后被观察到。被加至鸡胚绒毛尿囊膜上的表达niR-control的MDA-MB-231细胞能够穿透已破坏的基底膜,侵袭进入到结缔组织当中。相反的是,稳定表达miR-181 a-5p 的 MDA-MB-231细胞则未能穿透该基底膜。另外,相较于表达miR-181a-5p的细胞,载有表达miR-control细胞的鸡胚绒毛尿囊膜下能够观察到显著增多的新生血管。这种体内侵袭能力和血管生成能力的降低,提示miR-181a-5p能够有效地干扰高水平表达MMP-14的MDA-MB-231细胞的体内侵袭能力。为了进一步阐明miR-181a-5p通过下调MMP-14表达所发挥的抗血管生成功能,我们使用了HT1080细胞进行研究。由于HT1080细胞仅表达极少量的miR-181a-5p,因此我们在该细胞中稳定过表达了miR-181a-5p,然后像我们过去报道的那样,将吸附有细胞的明胶海绵置于绒毛尿囊膜表面。miR-181a-5p,而非miR-control,能够显著抑制HT1080细胞诱导的新生血管形成。综上所述,我们的研究首次阐明了miR-181a-5p是MMP-14表达水平的重要调节者,而且能够影响MMP-14介导的恶性肿瘤细胞迁移、侵袭和血管生成能力。结论本研究中,我们发现miR-181a-5p在高侵袭性人类乳腺癌以及人类结肠癌中表达水平下调,且与这些肿瘤的MMP-14表达水平呈负性相关。在临床样本中,相较于癌旁正常组织,我们发现MMP-14的表达水平在位于浸润前缘区域内的肿瘤组织中显著升高,而这些组织内的miR-181a-5p表达水平则显著降低。通过生物信息学分析,我们在MMP-14的3'-非翻译区内找到了潜在的miR-181a-5p应答元件,且在后续的报告基因实验中被我们所证实。过量表达的miR-181a-5p可显著降低MMP-14的表达水平,反之,干扰表达miR-181a-5p可造成MMP-14的表达水平显著升高。在进一步研究这两个基因间的相互关系时,我们发现miR-181a-5p介导的MMP-14表达下调,可使恶性肿瘤细胞的迁移能力、侵袭能力显著降低,同时可减少潜活状态基质金属蛋白酶-2(pro-MMP-2)的激活。此外,在鸡胚绒毛尿囊膜试验中,miR-181a-5p介导的MMP-14表达下调被证实可显著降低恶性肿瘤细胞的体内侵袭能力以及血管生成能力。综上所述,我们的研究成果阐明了miR-181a-5p在转录后水平对恶性肿瘤中MMP-14表达的调控机制,揭示了通过增强表达miR-181a-5p从而实现预防恶性肿瘤转移的新策略。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
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本文编号：2471834