【摘要】：背景:肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。临床上肺癌的治疗模式主要以手术切除为主,术后及无法手术的患者辅以全身化疗、放射治疗、新辅助治疗及靶向治疗为主的综合治疗模式。目前综合治疗对肺癌患者的预后有了一定的改善,但晚期患者的5年生存率只在5%左右。寻求更好的治疗模式是提高肺癌患者预后的重要方面之一。基因剪接是指在真核细胞中,遗传信息从DNA经过转录形成mRNA的过程中,去除内含子,连接外显子,再形成具有连续编码序列的mRNA分子,即mRNA前体去除内含子而保留外显子的修饰过程。剪接异常就是在mRNA水平,由于各种原因导致有功能的外显子或者内含子发生了异常而导致翻译水平不能正常进行,最终形成的蛋白质无法行使其相应的生物学功能。基因的剪接异常与肿瘤的发生密切相关。丝氨酸/精氨酸富集剪接因子1(serine/arginine-rich splicing factor 1,SRSF1)是选择性剪接因子家族的代表性成员,主要参与前体mRNA的剪接与加工,mRNA的运输,细胞周期、凋亡的调控等生理功能。SRSF1在多种肿瘤中表达都上调,少部分学者认为过表达SRSF1基因抑制肝癌细胞系Bel-7402和SMMC-7721在裸鼠内形成肿瘤,促进其RNA在核内降解。但多数报道一致认为,SRSF1是潜在的原癌基因,通过选择性剪接促进肿瘤的发展。目前SRSF1在肺癌中的相关机制尚无明确定论。本课题首先通过生物信息学分析,筛选与SRSF1有相互作用的基因,并分析这些基因的功能及所参与的信号通路;接着检测srsf1在肺癌细胞系及组织中的表达,并初步探讨srsf1基因与肺癌临床病理特征及预后的相关性;通过基因转染技术研究srsf1基因对肺癌细胞生物学行为的影响及可能机制;最后研究肺癌细胞中srsf1基因对抗肿瘤治疗敏感性的影响,以期为今后肺癌的治疗提供一个新方向。目的:1、检测srsf1基因在肺癌细胞系和肺癌组织中的表达,并初步探讨srsf1基因与肺癌临床病理特征及预后的相关性,以明确srsf1与肺癌的关系。2、探讨srsf1基因对肺癌细胞生物学行为的影响及可能的机制,为进一步研究奠定基础。3、研究肺癌细胞中srsf1基因对抗肿瘤治疗敏感性的影响,以期为未来肺癌的治疗提供一个新方向。方法:1、从cbioportal数据库中筛选与srsf1相关的基因,选取pearson值0.4的基因,利用string分析,绘出这些基因表达产物的蛋白网络图;利用geneontology分析及keggpathway分析,将这些基因的功能进行归类。2、在肺癌细胞系中,利用westernblot和q-pcr技术,检测srsf1蛋白及rna在8种肺癌细胞系及2种支气管上皮细胞系中的表达;在肺癌组织中,利用westernblot技术检测srsf1蛋白在7对肺癌组织及相应癌旁组织中的表达;进一步扩大样本量,利用免疫组化技术在60对肺癌组织芯片中检测srsf1的表达,并初步探讨srsf1基因与肺癌临床病理特征及预后的相关性。3、构建pcdh、srsf1、plko.1、srsf1-sirna1、srsf1-sirna2、srsf1-sirna3六种质粒并筛选出稳定表达及沉默目的基因的肺癌细胞株。设计分别带有相关酶切位点的上下游引物,用pcr克隆相关基因全长,琼脂糖凝胶电泳回收pcr产物,进行酶切、纯化、连接并在大肠杆菌中转化。用相应的抗生素对转化产物进行菌落pcr阳性克隆鉴定及筛选。从大肠杆菌中提取目的质粒,酶切验证并测序,序列正确的质粒检测蛋白表达正常后用于慢病毒转染。hek293t细胞包装目的质粒、辅助质粒及慢病毒颗粒,收集病毒液上清,感染靶细胞nci-h1299并筛选稳定表达的细胞株。用westernblot和q-pcr技术检测srsf1基因的表达情况,确定表达正确后,用平板克隆实验、划痕愈合实验、transwell体外迁移及侵袭实验、细胞凋亡及周期检测实验、裸鼠成瘤实验等,来研究srsf1基因对肺癌细胞生物学功能的影响,并用westernblot方法探讨相关机制。4、选取pcdh、srsf1、plko.1、srsf1-sirna2四种细胞株,采用化疗、热疗、放疗及以热疗为基础的联合抗肿瘤治疗方式来研究srsf1基因对肺癌细胞抗肿瘤治疗的敏感性。通过顺铂(ddp)敏感性实验,计算出各细胞株对ddp的ic20值和ic50值;利用cck-8实验、流式细胞术检测抗肿瘤治疗对肺癌细胞株增殖及凋亡的影响。结果1、与srsf1相关的蛋白共2678个,其功能主要富集在细胞周期、dna代谢过程、dna损伤修复、dna复制、应激、rna剪接等区域;这些蛋白主要参与了细胞周期、剪接体形成、泛素介导的蛋白降解、rna无义降解、p53、tgf-β等信号通路中。2、srsf1蛋白在nci-h1299,nci-h446,nci-h2170和nci-h520肺癌细胞系中表达增高,其rna在nci-h1299,nci-h446,nci-h358和nci-h520肺癌细胞系中表达增高。srsf1蛋白在7对肺癌组织中表达明显高于相应癌旁组织,其在60对肺癌组织芯片中的阳性表达率为95%,明显高于相应的癌旁肺组织(13.33%),两者比较具有统计学差异(p0.0001)。3、srsf1的表达水平与肺癌肿瘤大小、t分期、n分期及临床分期呈正相关(p0.05),而与肺癌患者年龄、性别、病理类型无明显相关(p0.05);srsf1阴性或者弱阳性(-/+)表达的患者,其1年、3年、5年生存率分别为93.90%、72.09%、59.30%,srsf1强阳性(++)表达的患者1年、3年、5年生存率分别为64.20%、24.10%、4.02%,两组比较具有显著统计学差异(p0.0001)。4、利用基因重组和小干扰rna技术构建过表达及沉默srsf1基因的nci-h1299肺癌细胞系,用westernblot和q-pcr技术对srsf1基因过表达及沉默效果进行检测。结果表明,在nci-h1299细胞系中过表达srsf1基因后,其蛋白水平及rna水平明显增加;沉默srsf1的三种sirna序列,其中sirna1和sirna2两种序列沉默srsf1基因效果较好。5、过表达srsf1基因促进肺癌细胞生长、迁移、侵袭及裸鼠成瘤能力,减少肺癌细胞凋亡,改变细胞周期。平板克隆实验表明,srsf1组形成的克隆率(63.93%±2.01%)比mock组(43.14%±1.94%)和control组(43.41%±0.85%)增多,结果有统计学差异(p0.01);划痕愈合实验表明,srsf1组比control组和mock组在6h及16h的划痕愈合速率均增快(p0.05);transwell体外迁移实验表明,srsf1组穿过小室的细胞数目(334.6±18.4)比control组(214.4±17.4)及mock组(217.2±13.8)增多(p0.01);transwell体外侵袭实验表明,srsf1组侵袭基质胶并穿过基底膜的细胞数目(367.6±17.4)比control组(236.4±13.4)及mock组(251.6±12.6)增多(p0.01);流式细胞仪凋亡检测结果显示,srsf1组凋亡细胞所占比例(2.8%±0.3%)比control组(5.8%±0.7%)减少,但无统计学差异(p0.05);srsf1过表达后改变细胞周期,g0/g1期细胞比例由control组的51.43%±0.21%降到srsf1组的38.05%±4.47%(p0.05),g1/g2期细胞由control组的14.09%±0.38%降到srsf1组的1.32%±0.62%(p0.05),s期细胞由control组的34.49%±0.59%提高到srsf1组的62.0%±4.47%(p0.05);动物实验表明,srsf1组裸鼠成瘤率(87.50%)高于control组(62.50%),srsf1组裸鼠所形成的肿瘤重量(1650.60±1200mg)重于control组(328.42±249.18mg),结果又统计学差异(p0.001)。6、沉默srsf1基因抑制肺癌细胞生长、迁移及侵袭能力。平板克隆实验结果显示,sirna1组(14.21%±0.93%)和sirna2组(26.89%±2.13%)的克隆形成率少于对照组control(53.35%±2.15%)及mock(52.43%±1.83%),结果具有统计学差异(p0.01);划痕愈合实验结果表明,sirna1组和sirna2组的划痕愈合速度在6h和20h均比对照组减慢(sirna1组p0.01,sirna2组p0.05);transwell体外迁移实验显示,sirna1组(21.4±10.4)和sirna2组(86.2±19.2)穿过小室的细胞数目比control组(343±18)及mock组(344.4±30.4)减少(p0.001);transwell体外侵袭实验表明,sirna1组(196.4±20.4)和sirna2组(295.2±21.2)侵袭基质胶并穿过基底膜的细胞数目比control组(508.4±19.4)及mock组(507.4±20.4)明显减少(p0.01)。7、过表达srsf1基因后,间质标志的蛋白n-cadherin、snail表达增加,同时上皮标志的蛋白e-cadherin表达下降;当srsf1基因沉默后,e-cadherin表达增高,而N-cadherin及Snail表达下降。8、过表达SRSF1基因,降低肺癌细胞对抗肿瘤治疗的敏感性。顺铂敏感性实验结果显示,SRSF1组的肺癌细胞对顺铂的IC20值为9.21±2.13?g/ml,IC50值为24.82±4.02?g/ml,高于pCDH组的IC20值(6.71±3.16?g/ml)和IC50值(14.09±2.76?g/ml),两者比较均具有统计学差异(P0.05)。CCK-8实验表明,抗肿瘤治疗对SRSF1组细胞的增殖抑制作用弱于pCDH组;热疗联合化疗或者放疗比单一治疗更能抑制细胞增殖。流式细胞仪凋亡检测实验证实,抗肿瘤治疗后SRSF1组细胞凋亡比例少于pCDH组,放疗组及联合治疗组有统计学差异(P0.05);热疗联合化疗或放疗比单一治疗增加了细胞的凋亡比例。9、沉默SRSF1基因,增加肺癌细胞对抗肿瘤治疗的敏感性。siSRSF1组的肺癌细胞对顺铂的IC20值为2.88±1.23?g/ml,IC50值为6.62±1.15?g/ml,低于pLKO.1组的IC20值(6.13±2.47?g/ml)和IC50值(13.90±2.30?g/ml),两组比较具有统计学差异(P0.01)。CCK-8实验表明,抗肿瘤治疗对siSRSF1组细胞的增殖抑制作用强于pLKO.1组;热疗联合化疗或者放疗比单一治疗更能抑制细胞增殖。流式细胞仪凋亡检测实验表明,抗肿瘤治疗后si SRSF1组细胞凋亡比例明显多于pLKO.1组,各组均具有统计学差异(P0.05);热疗联合化疗或者放疗比单一治疗增加了细胞的凋亡比例。结论1、SRSF1在肺癌中表达增高,并与肺癌的生长及淋巴结转移呈正相关。2、SRSF1基因高表达是影响肺癌患者预后的重要危险因素,有可能成为肺癌评价预后及监测疗效的指标之一。3、SRSF1基因促进肺癌细胞的恶性生物学行为。4、SRSF1基因可能通过正向调控转录因子Snail的表达来调控肺癌细胞EMT的发生。5、SRSF1基因的表达水平与肺癌细胞抗肿瘤治疗的敏感性呈负相关。6、热疗可以增加肺癌细胞对化疗及放疗的敏感性。7、下调SRSF1基因有望为肺癌的治疗提供新的方向和新的靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
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本文编号：
2475155
