【摘要】：目的:在多种恶性肿瘤中发现9号染色体短臂上24.1基因片段的扩增(以下称为9p24.1扩增),临床上发现与缺乏9p24.1扩增组相比,该类肿瘤分期晚,病人预后差。染色体9p24.1扩增主要包括JAK2、PD-L1、PD-L2。JAK/STAT信号通路在三阴性乳腺癌及炎性乳腺癌中多为激活状态,该信号通路的激活与肿瘤的转移密切相关。在慢性炎症周围及肿瘤细胞表面发现PD-1和PD-L1的高表达,该通路的激活形成免疫抑制微环境,参与肿瘤细胞的免疫逃逸,促进肿瘤的扩散及转移。美国食品药品管理局批准JAK1/2抑制剂在骨髓纤维化的病人中使用并获得了很好的临床治疗效果。与此同时,PD-1/PD-L1抑制剂也被批准用于晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌及膀胱癌的临床应用,并取得了突破性的治疗进展。前期的临床试验显示,在三阴性乳腺癌检测出9p24.1扩增,并且发现具有9p24.1扩增的病例JAK2及PD-L1的m RNA表达水平上调。我们假设9p24.1扩增是具有临床意义的癌基因,该扩增能够激活JAK/STAT信号通路和PD-1/PD-L信号通路。我们推测具有9p24.1扩增的三阴性乳腺癌能够从JAK2抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂治疗中获益。本研究通过比较基因组杂交芯片技术(array-based Comparative Genomic Hybridization,a CGH,以下称为a CGH技术)筛选出具有9p24.1扩增片段的三阴性乳腺癌细胞系,建立9p24.1扩增三阴性乳腺癌细胞系模型,探索该扩增片段对三阴性乳腺癌生物学功能的影响及参与调控的信号通路机制。在已有的研究基础上,探索JAK2及PD-L1的相互作用以及对三阴性乳腺癌细胞增殖的影响。此外,我们应用RNA测序技术,探索9p24.1扩增对免疫相关基因的表达影响,寻找潜在的治疗靶点。该研究同时致力于9p24.1扩增片段在临床诊断和预测的应用,通过免疫荧光杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)技术,验证JAK2 FISH探针在三阴性乳腺癌组织标本中的特异性和敏感性,通过组织标本RNA测序,在组织样本中验证9p24.1扩增片段对JAK2及PD-L1的表达影响。方法:1.通过DNA提取技术获得11个三阴性乳腺癌细胞系DNA,应用a CGH技术检测每个细胞系9p24.1基因片段的扩增水平,筛选出具有9p24.1扩增片段的三阴性乳腺癌细胞系。2.应用慢病毒感染技术,建立JAK2降表达的稳定三阴性乳腺癌细胞,包括具有9p24.1基因片段扩增的HCC70和MDA-MB-436和不具有9p24.1基因片段扩增的MDA-MB-231。3.使用Western Blot技术、流式细胞术及RT-PCR检测9p24.1基因片段所包含的基因JAK2、PD-L1、Relaxin的表达水平,分析9p24.1基因片段的扩增对这些基因的影响。4.使用针对PD-L1的小RNA(si RNA)干扰技术,降表达细胞表面PD-L1蛋白表达水平,通过发光法细胞活力检测试剂盒对JAK2降表达、PD-L1降表达的细胞进行细胞增殖分析。5.对三阴性乳腺癌细胞系使用不同剂量的JAK2抑制剂Ruxolitinib治疗72小时后用发光法细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。同时在0到36小时不同时间点保存细胞蛋白裂解液,之后用于Western Blot检测可能受到该抑制剂影响的信号通路。6.干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素-6(interlukin-6,IL-6)及表皮生长因子(epithelial growth factor,EGF)都能够激活JAK/STAT信号通路,分别使用以上3种细胞因子刺激三阴性乳腺癌细胞系并通过流式细胞术检测细胞表面PD-L1的表达水平。7.收集福尔马林固定后石蜡包埋三阴性乳腺癌肿瘤组织样本,通过流式细胞术筛选出非整倍体细胞,提取DNA并用于a CGH分析三阴性乳腺癌组织标本9p24.1基因片段的扩增水平。8.福尔马林固定后石蜡包埋组织RNA提取试剂盒用于提取三阴性乳腺癌组织样本RNA,随后使用RNA表达水平检测芯片(770个免疫相关基因芯片)检测分析9p24.1基因片段的扩增对三阴性乳腺癌肿瘤组织中免疫相关基因表达水平的影响。9.通过JAK2免疫荧光原位杂交探针,检测三阴性乳腺癌组织标本9p24.1基因片段的扩增水平,并分析其特异性和敏感性。结果:1.本研究共收集40例来自美国梅奥诊所(菲尼克斯)三阴性乳腺癌组织标本进行研究,通过筛选,34例病例纳入分析。其中15例样本具有9p24.1基因片段扩增,19例样本未检测出9p24.1基因片段扩增。大部分病例初诊年龄在50岁及以上,多数原发肿瘤临床分期较早,符合三阴性乳腺癌在美国女性中的分布及发病特点。2.通过a CGH分析11例来源于ATCC(American type culture collection)的三阴性乳腺癌细胞系,a CGH log2 ratio在0.5及以上的细胞系为具有9p24.1基因片段扩增,一共有4个三阴性乳腺癌细胞系具有9p24.1基因片段扩增,它们为MDA-MB-157、BT549、MDA-MB-436及HCC70。通过Western Blot对9个乳腺癌细胞系中JAK2,p STAT3及p STAT5基础表达水平分析发现,与非三阴性乳腺癌相比,三阴性乳腺癌细胞系有较高的JAK2水平及伴随JAK2/STAT3信号通路的激活。在非三阴性乳腺癌细胞系中并没有发现基础水平JAK2/STAT3信号通路的激活。在三阴性乳腺癌细胞系中,具有9p24.1基因片段扩增的细胞系JAK2表达上调并伴随JAK2/STAT3信号通路的激活。3.Western Blot技术检测细胞内JAK2的表达水平,验证了JAK2降表达三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、HCC70及MDA-MB-436成功建立及JAK2降表达后影响STAT3磷酸化及JAK2/STAT3信号通路的激活。JAK2降表达乳腺癌细胞系细胞增殖水平与野生型及阴性对照相比,JAK2降表达后细胞增殖降低(p0.0001)。Western Blot结果显示JAK2降表达后,阻碍JAK2/STAT3信号通路的激活,提示JAK2/STAT3信号通路参与三阴性乳腺癌细胞增殖。对三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC70及MDA-MB-436使用不同剂量的JAK1/2抑制剂Ruxolitinib(0到25μM),发现MDA-MB-436及HCC70对Ruxolitinib不敏感,而从10μM开始MDA-MB-231细胞增殖受到抑制。4.在MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-436及HCC70中,Western Bolt显示,从第30分钟开始,STAT3的磷酸化开始受到显著抑制,并且这种抑制效果一直延续至36小时,JAK2蛋白水平并没有发生改变。与STAT3不同,STAT5、AKT的磷酸化并没有收到影响,提示Ruxolitinib并不影响JAK2/STAT5以及PI3K/AKT信号通路的激活。Western Blot结果显示,在这4个细胞系中,低剂量Ruxolitinib(1μM)就能够抑制STAT3磷酸化,从而抑制JAK2/STAT3信号通路的激活。5.流式细胞术检测6种乳腺癌细胞系细胞表面PD-L1基础表达水平发现,在纳入研究的细胞系中与非三阴性乳腺癌相比,三阴性乳腺癌细胞表面PD-L1基础表达水平要高。在三阴性乳腺癌细胞系中,PD-L1基础表达水平与细胞内9p24.1基因片段扩增状态并没有关系。在MDA-MB-231及HCC70中,降表达JAK2或是加入Ruxolitinib培养,细胞表面PD-L1基础表达水平并没有受到影响,提示在乳腺癌细胞中JAK2/STAT3并不参与PD-L1基础表达水平的调节。使用IFN-γ(1ng/ml)刺激24小时后,流式细胞术结果提示IFN-γ诱导细胞表面PD-L1表达水平与细胞内9p24.1基因片段扩增水平相关,染色体9p24.1基因片段扩增增强了细胞对IFN-γ的敏感性。6.IFN-γ通路的激活包含了JAK1和JAK2以及STAT1的磷酸化。在JAK2降表达后,IFN-γ不能诱导细胞表面的PD-L1表达,但是JAK2降表达不影响PD-L1的基础表达水平。流式细胞结果显示,Ruxolitinib能够完全抑制IFN-γ对细胞表面PD-L1表达的诱导作用。Western Blot结果显示,Ruxolitinib能够抑制JAK2/STAT1通路的激活,从而抑制IFN-γ对细胞表面PD-L1诱导表达。7.在使用针对PD-L1的si RNA降表达MDA-MB-231、MDA-MB-436及HCC70的细胞表面PD-L1。与野生型及对照组相比,PD-L1降表达的细胞细胞增殖并没有明显改变,PD-L1表达水平的降低不影响细胞对Ruxolitinib的敏感性。8.IL-6和EGF都能够诱导JAK/STAT通路的激活。IL-6和EGF不能诱导乳腺癌细胞表面PD-L1的表达。IL-6和EGF能够促进MDA-MB-231和HCC70的细胞增殖。1μM的Ruxolitinib只能够抑制IL-6和EGF在HCC70中的促进细胞增殖作用。这些实验结果提示,染色体9p24.1基因片段的扩增增加了肿瘤细胞对细胞因子的敏感性,从而使得这些肿瘤更具侵袭和转移性。9.a CGH结果显示,在纳入研究的34例组织样本中,15例具有染色体9p24.1基因片段的扩增(44.1%),19例(55.9%)不具有染色体9p24.1基因片段的扩增。与a CGH相比,免疫荧光原位杂交JAK2探针具有很好的特异性(94.7%)和敏感性(80.0%)(p=0.02)。FISH检测13例组织样本9p24.1基因片段扩增,21例组织样本不具有9p24.1基因片段扩增,与a CGH符合率较好(r=0.83,p0.05)。其中,在a CGH定义的染色体9p24.1基因片段的扩增15例病例中,FISH检测与之相符的为12例。在a CGH定义的不具有染色体9p24.1基因片段扩增的19例病例中,FISH检测与之相符的为18例。10.细胞内JAK2的表达水平与染色体9p24.1基因片段扩增相关,染色体9p24.1基因片段扩增组JAK2m RNA表达水平显著升高(p=0.02)。与JAK2m RNA不同,在这两组之间,PD-L1、PD-L2 m RNA表达水平变化较大,且两组间m RNA表达水平差异并不显著。经过对770个免疫相关基因m RNA表达水平的统计学分析,我们发现29个基因在这两组间存在显著性差异(p0.05)。其中有6个基因(PSMB9,TAPBP,HLA-DRB4,HLA-DPA1-PSMB8,VCAM1)在染色体9p24.1基因片段扩增组过表达,这些基因都受到IFN-γ通路的调控,提示在染色体9p24.1基因片段扩增组中IFN-γ通路较为活跃。结论:本研究通过临床组织样本采集、细胞基础实验验证,揭示了染色体9p24.1基因片段的扩增在三阴性乳腺癌免疫逃逸中的重要作用。染色体9p24.1基因片段的扩增通过JAK2/STAT1信号通路,增加细胞对IFN-γ诱导细胞表面PD-L1表达的敏感性,JAK2抑制剂能够完全阻断IFN-γ的诱导作用,提示在三阴性乳腺癌中联合使用JAK2抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂的治疗前景。同时,机体内PD-L1的表达水平是一个很易受到肿瘤微环境影响的蛋白,染色体9p24.1基因片段的扩增水平能够达到和Erb B2/HER2相同的水平,提示FISH检测染色体9p24.1基因片段的扩增水平能够作为预测PD-1/PD-L1抑制剂治疗疗效和患者预后的指标之一。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9
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本文编号：2475603
