基于靶向外显子深度测序的转移性乳腺癌患者循环肿瘤DNA定量检测及其临床应用研究

发布时间：2019-05-17 11:43

【摘要】：无论从发达国家还是从发展中国家,无论从每年新发病例数量出发还是从每年死亡情况来看,乳腺癌都是威胁女性健康最常见的癌症。其中,转移性乳腺癌(Metastatic Breast Cancer, MBC)仍是不可治愈的疾病,治疗目的主要是为了减轻症状,改善生活质量和延长生存期。因此,为了避免无效治疗的持续、为了预防不必要的医疗毒性、为了明确治疗应答、合理搭配宝贵的医疗资源,筛选高灵敏并且强特异的生物标志物用于监测转移性乳腺癌患者治疗过程中肿瘤负荷的变化,具有重要的科学及社会意义。随着近年来肿瘤细胞生物学及分子生物学的深入研究,以及检测技术手段的快速发展,循环肿瘤标记由于检测的便利性和非侵入性正逐步取代受到标本采集以及无法连续监测追踪等诸多限制的组织学肿瘤标记用于肿瘤治疗过程中反应的监测。如癌抗原15-3(CA 15-3)和循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells, CTC)等标志物已得到广泛研究。随着“液体活检”概念的推广,携带有肿瘤特异性变异的循环肿瘤DNA (Circulating Tumor DNA, ctDNA)逐渐被人们所重视,并成为肿瘤细胞生物学及分子生物学研究领域的热点和亮点。第一章基于数据挖掘技术的乳腺癌靶向外显子的筛选和验证背景：对于癌症来说,发生突变的基因仅占整个基因组的很小一部分,这表明只有有限数量的基因参与了某一类型癌症的发生和发展。因此,只有这些与癌症相关联的一组基因是监测治疗过程中肿瘤负荷变化所必需的。但遗憾的是尚无一种能够科学完整而又非常集约化的策略来明确这些与特定肿瘤类型相关的目标基因区域。目的：本部分拟基于生物信息学和数据挖掘技术筛选出与乳腺癌高度相关的目标基因区域,为后续的靶向捕获测序提供靶标,减少盲目性,节约实验成本,使检测技术的针对性更强,适用性更广。方法：从癌症基因组图谱库(TCGA)中963例乳腺癌患者中,随机选取776例作为训练集,剩余的187例作为预测集；基于肿瘤体细胞突变目录(COSMIC)数据库,筛选出乳腺癌相关基因突变所在的基因功能区域；用筛选出的潜在“靶向区域(Selector)",覆盖训练集中乳腺癌患者的遗传学改变信息进行；应用迭代算法使"Selector"在覆盖训练集中尽可能多的患者的同时达到尽可能的精简；使用生物信息学分析技术对"Selector"所涉及基因,进行KEGG pathway和Gene Ontology分析；最后通过预测集乳腺癌患者和临床生物标本对已筛选出的"Selector"进行覆盖度验证并优化完善。结果："Selector"共计包含了834个乳腺癌相关基因,961个外显子,23982049个单核苷酸变异(SNVs),134个Indels,52个Fusions,长度为118.24kb,遍布在所有编号染色体上。按照生物学过程分类："Selector"所涉及基因所属的GO-BP分类有1348个,最多的5种途径分别是：cellular component organization or biogenesis,cellular component organization,collagen catabolic process, single-organism developmental process和multicellular organismal catabolic process。按照细胞组件注释："Selector"所涉及基因所属的GO-CC分类有239个,前五位分别是:cell projection, cytosol, endoplasmic reticulum lumen, membrane region和cytoplasm。按照分子功能注释："Selector"所涉及基因所属的GO-MF分类有269个,前5种功能分别是：ATP binding, adenyl ribonucleotide binding, adenyl nucleotide binding, anion binding和extracellular matrix structural constituent.."Selector"所涉及基因可能参与调节的KEGG信号通路包括73条,前五位主要涉及黏着斑、子宫内膜癌、小细胞肺癌、阿米巴病和促性腺激素释放激素信号通路。"Selector"在训练阶段可以覆盖100%的乳腺癌患者,预测集验证阶段亦可以覆盖高达88.7%的乳腺癌患者,平均识别每位患者2个及以上SNVs。40例独立转移性乳腺癌患者不同治疗阶段的72份生物标本验证结果显示,该区域可以覆盖100%的患者和生物标本。结论："Selector"有效的将乳腺癌相关的靶向测序区段浓缩至整个基因组大小的3.7/10万,使得后续深度测序得以实现,为后续研究提供了靶标,减少了实验测序盲目性,节约了实验成本。第二章转移性乳腺癌患者治疗前后血浆游离DNA水平变化及其监测价值研究背景：能否成功延长转移性乳腺癌患者的生存期主要与疗效监测、更换治疗方案时机的把握程度密切相关。但目前用于治疗过程中疗效监测的影像学改变和传统生物标志物多具有敏感性和特异性不足的缺点。外周血游离DNA(Circulating Cell Free DNA, cfDNA)作为一种新的肿瘤标志物,在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面均具有广阔的应用前景。目的：本部分以β-actin为目标管家基因,以已知浓度的人类基因组DNA为标准品,基于Digital PCR技术平台定量检测cfDNA的浓度水平(Genome Equivalent/mL, GE/mL),系统分析转移性乳腺癌患者化疗前后cfDNA水平的变化规律,评估血浆cfDNA在转移性乳腺癌患者病情监测、疗效评价、预后转归预测中的应用价值。阐明cfDNA检测作为一种快速、微创、敏感、特异的转移性乳腺病情和疗效监测指标的可行性。方法：采用前瞻性临床病例队列研究的设计方法,对40例具有明确可测量转移病灶的首程化疗乳腺癌患者,进行前瞻性预后随访并采集外周血标本直至第150天或不良预后事件(疾病进展)出现。以β-actin作为检测靶基因,运用DigitalPCR技术检测全组转移性乳腺癌患者治疗前后各随诊时点外周血cfDNA水平。分析转移性乳腺癌患者外周血cfDNA水平在治疗过程中的变化规律,以及与临床特征和预后的关系。结果：全组病例中位随访时间为106天(67-113天),肿瘤无进展生存率为50.2%；治疗前和首程化疗后随诊时的cfDNA中位基因组当量分别为1015(749.3-1315.3)与916.5 (519.3-1124.3) GE/mL,治疗前后Wilcoxon配对秩和检验结果显示无统计学差异(Z=-1.74,P=0.08)。转移性乳腺癌患者治疗前后各时点外周血cfDNA水平变化非参数Friedman检验结果显示无统计学差异(χ2=5.26,P=0.39)。Mann-Whitney U检验结果显示不同临床特征组转移性乳腺癌患者治疗前后各时点外周血cfDNA水平的差异均无统计学意义(P值均大于0.05)。ROC曲线分析结果显示治疗前和首程化疗后血浆游离DNA水平预测疾病短期进展的曲线下面积分别为0.66 (95%CI:0.48-0.82, z=1.65, P=0.09)和0.60(95%CI：0.42-0.76, z=0.91, P=0.37);最佳切点分别为9386 GE/mL和812 GE/mL,对应的灵敏度和特异度分别为70.0%和66.7%,80.0%和54.2%。短期疗效分析发现全组患者治疗前外周血游离DNA水平9386 GE/mL组的中位无进展生存期(126天)和无进展生存率(44.7%)均优于9386 GE/mL组(110天和40.9%), Log-rank (Mantel-Cox) test检验结果显示χ2=4.05,P=0.04。在校正了年龄、月经生育史、ER, PR和Her2表达状态、肿瘤大小和内脏转移情况之后的多因素Cox回归分析结果显示：与9386 GE/mL组相比,治疗前外周血cfDNA水平9386 GE/mL组患者(HR=13.27,95%CI:1.14-154.16)在治疗过程中发生短期疾病进展的风险显著增加。结论：转移性乳腺癌患者治疗过程中各时点血浆cfDNA水平变化无统计学差异,且与肿瘤临床特征、患者疾病健康史未见统计学关联。转移性乳腺癌患者治疗前血浆中cfDNA水平对患者短期疗效转归具有一定的的预测价值,但灵敏度和特异度均不太理想。第三章基于靶向外显子深度测序的转移性乳腺癌患者循环肿瘤DNA定量检测及监测价值研究背景：随着“液体活检”的概念深入人心,从传统标记物到循环肿瘤细胞(CTC),紧接着一部分研究者对循环系统内的来自肿瘤组织的核酸片段(循环肿瘤DNA, ctDNA)产生了越来越浓厚的兴趣。ctDNA是一种有前景的无创性评估肿瘤负荷的生物标志物,但现有针对ctDNA检测的方法多具有灵敏度不足或缺乏广泛的临床适用性的缺点。而且由于乳腺癌患者之间的高度遗传异质性,目前最为流行的是通过组合几个已知突变来定量癌症患者cfDNA中ctDNA浓度水平的技术,但这一技术却面临着严重的患者覆盖度低的问题。目的：本部分拟在第一部分和第二部分研究成果的基础上,建立一种超灵敏高覆盖的ctDNA定量检测技术。进而系统分析转移性乳腺癌患者化疗前后血浆ctDNA水平的变化规律及其与临床特征之间的关系；比较治疗前后ctDNA与癌抗原CA 15-3及cfDNA在转移性乳腺癌患者随访监测、治疗效果评价、预后转归评价中应用价值的优劣。本部分旨在阐明血浆ctDNA定量检测作为一种快速、微创、敏感、特异的转移性乳腺随访疗效观察和耐药性监测指标的可行性。方法：本研究采用靶向捕获深度测序的技术对40例转移性乳腺癌患者的外周血进行乳腺癌相关基因区域突变的检测,经过对照血细胞和血浆样本的循环游离DNA基因遗传学改变,筛选出血细胞样本阴性、血浆样本阳性的乳腺癌特异性基因突变,结合生物信息学分析方法计算出ctDNA在cfDNA中的占比；结合第二部分外周血cfDNA的定量结果计算出转移性乳腺癌患者治疗前后各时点的ctDNA水平。进而分析转移性乳腺癌患者血浆ctDNA水平在治疗过程中的变化规律,以及与临床特征和预后的关系；并评价ctDNA与癌抗原CA 15-3及血浆cfDNA在转移性乳腺癌随访监测、治疗效果评价、预后判断中应用价值的优劣。结果：(1)乳腺癌特异性基因突变检测：应用乳腺癌相关基因目标区域靶向捕获深度测序技术检测乳腺癌特异性体细胞基因突变,平均测序深度～2000×。结果显示：在40例转移性乳腺癌患者治疗前和首程化疗后随诊时采集的共计72例标本中,100%检测到此前确定的SNVs,并发现了许多额外的体细胞变异。(2)ctDNA水平定量：治疗前和首程化疗后随诊时的血浆ctDNA在cfDNA中占比分别为1.28%(0.56%-2.57%)和1.56%(0.80%-3.07%),中位基因组当量分别为136.1(60.5-238.5) GE/mL和136.3(52.4-239.4) GE/mL,治疗前后Wilcoxon配对秩和检验结果显示差异无统计学意义(Z=-0.17, P=0.86)。(3) Mann-Whitney U检验结果显示：不同Her2表达状态和是否合并糖尿病组间转移性乳腺癌患者血浆ctDNA水平差异存在统计学意义：Her2+组患者治疗前ctDNA中位数为114.1(45.9-206.4) GE/mL,明显低于Her-组的224.2 (102.8-274.2) GE/mL;合并糖尿病患者首程化疗ctDNA水平远高于未合并糖尿病患者(357.0 GE/mL vs. 125.6 GE/mL). (4) cfDNA, ctDNA和CA15-3在患者中检测灵敏度比较结果显示：癌抗原CA15-3在患者和标本中的异常(25U/mL)检出率分别为46.9%和44.4%; cfDNA在患者和标本中的异常(9386 GE/mL)检出率分别为70%和52.8%：而ctDNA无论在患者中还是所有标本中,检出率均为100%。(5)疾病进展组和疾病稳定缓解组之间,治疗前后癌抗原CA15-3和cfDNA的浓度差异均无统计学意义(P0.05),但疾病进展组患者的ctDNA水平(治疗前-223.4GE/mL,首程化疗-259.0 GE/mL)明显高于疾病稳定缓解组(治疗前-111.4 GE/mL,首程化疗-86.1 GE/mL), P值均小于0.05. (6) cfDNA、ctDNA和CA15-3首程化疗后是否升高与疾病进展的关联性分析结果显示：与治疗前相比,ctDNA水平升高组中发生短期疾病进展的比例高达47.1%,与ctDNA水平降低组(11.8%)相比,差异有统计学意义(χ2=5.10,P=0.02)；与治疗前相比CA15-3浓度升高组中短期疾病进展比例达42.9%,与CA15-3浓度降低组(12.5%)相比,差异无统计学意义(χ2=3.52,P=0.06)；与治疗前相比cfDNA水平升高组中短期疾病进展比例达50%,与cfDNA水平降低组相比(18.2%),呈边缘性统计学差异(χ2=3.79, P=0.05)。(7) ROC曲线分析结果显示治疗前后血浆ctDNA预测短期疾病进展的曲线下面积分别为0.74 (95%CI:0.56-0.87, z=2.33, P=0.02)和0.86 (95%CI:0.70-0.95, z=4.51, P=0.0001),与参考线相比均达统计学差异；最佳切点分别为135.21 GE/mL和183.34 GE/mL,对应的灵敏度和特异度分别为90.0%和58.3%,90.0%和79.2%。(8)短期疗效分析发现,治疗前外周血ctDNA≤135.21 GE/mL组的无进展生存率明显高于后者(92.3%和27.1%),Log-rank (Mantel-Cox) test检验结果显示χ2=4.95,P=0.03。首程化疗≤183.34GE/mL组的无进展生存率(88.8%)明显高于183.34 GE/mL组(18.8%),Log-rank (Mantel-Cox) test检验结果显示χ2=8.98,P=0.002。(9)在校正了年龄、月经生育史、ER、PR和Her2表达状态、肿瘤大小和内脏转移情况之后的多因素回归分析结果显示：与首程化疗外周血血浆ctDNA≤183.34 GE/mL组相比,首程化疗外周血血浆ctDNA183.34 GE/mL组(HR= 39.02,95%CI:1.19-1284.67)患者在治疗过程中发生疾病短期进展的风险显著增加。(10)案例分析结果显示,ctDNA的动态变化能够灵敏地反映转移性乳腺癌患者病情的进展和缓解,而cfDNA的动态变化与转移性乳腺癌患者病情的进展并不尽一致。结论：(1)本研究建立了一种对乳腺癌相关基因进行靶向捕获深度测序的方法,可实现对转移性乳腺癌患者血浆ctDNA高覆盖超灵敏的定量,为转移性乳腺癌患者治疗过程中的疗效监测提供了一种可行的“液体活检”方案。(2)不同Her2表达状态、是否合并糖尿病基础疾病会影响转移性乳腺癌患者血浆ctDNA浓度水平的高低。(3) ctDNA在转移性乳腺癌患者的检测灵敏度优于CA15-3和cfDNA异常升高检出率,并且与治疗过程中肿瘤负荷的动态变化高度相关。(4)转移性乳腺癌患者首程化疗后血浆中ctDNA水平检测对患者短期疗效转归具有良好的预测价值。(5)与治疗前相比首程化疗后血浆ctDNA升高者和首程化疗后ctDNA高于183.34 GE/mL者疾病在短期内进展的风险显著升高。(6)与cfDNA相比,ctDNA的动态变化能够更灵敏地反映转移性乳腺癌患者病情的进展和缓解。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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