PRAS40-Thr246磷酸化在HER2阳性乳腺癌trastuzumab耐药中的作用机制的研究

发布时间：2019-06-06 00:23

【摘要】：研究背景Trastuzumab等HER2靶向药物耐药是HER2阳性乳腺癌治疗研究中的热点问题之一。有研究表明,PI3K-AKT信号通路异常激活是HER2靶向药物耐药的关键分子基础,但其机制有待进一步阐明。PRAS40的Thr246位点磷酸化(p-PRAS40-Thr246)是最近发现的能代表PI3K-AKT信号通路激活状态的分子标记,p-PRAS40-Thr246是PI3K-AKT通路激活重要的下游因子,并与脂类代谢异常相关。我们的前期研究发现p-PRAS40-Thr246在乳腺癌标本中表达升高,并是乳腺癌预后的独立影响因子。据此,我们提出"PRAS40-Thr246磷酸化可能是HER2阳性乳腺癌细胞trastuzumab耐药的关键调控因子和耐药逆转靶点”的假说,并拟针对以下科学问题进行深入研究：1.从临床水平开展更大样本量的验证,以明确p-PRAS40-Thr246与HER2阳性乳腺癌trastuzumab耐药的相关性,探讨其与乳腺癌各临床病理参数及其乳腺癌患者预后之间的关系；2.从细胞水平验证p-PRAS40-Thr246是否是PI3K-AKT通路导致trastuzumab耐药的关键因子；3.通过建立乳腺癌trastuzumab耐药的裸鼠动物模型,验证拮抗p-PRAS40-Thr246能否逆转乳腺癌的trastuzumab耐药。期望通过以上研究进一步阐明HER2阳性乳腺癌trastuzumab耐药的新机制,为trastuzumab和MK-2206联合治疗HER-2阳性乳腺癌方案的临床应用提供研究依据。第一部分PRAS40-Thr246磷酸化与HER2阳性乳腺癌组织trastuzumab耐药的相关性的临床研究目的通过对临床乳腺癌组织标本的检测及病例资料的分析,探讨乳腺癌组织p-PRAS40-Thr246的表达水平与其临床病理资料、PI3K-AKT信号通路激活状态之间的相关性。并分析P-PRAS40-THR24是否能成为预测乳腺癌trastuzumab治疗效果的分子标记物。材料和方法：收集了55例HER2阳性的原发性乳腺癌的癌组织标本,这些患者术后均应用trastuzumab治疗。所有标本都是术中取材,并且通过福尔马林固定、石蜡包埋的保存。所有的肿瘤临床病理资料、治疗情况和后续的疾病进展情况都是从患者的病历及随访资料中获得的。本实验应用免疫组织化学的方法检测。p-PRAS40-Thr246和PTEN在乳腺癌组织中的表达情况；应用等位基因特异PCR检测PIK3CA基因的突变情况。P-PRAS40-Thr246表达与其他临床病理资料的相关性分析是用卡方检验来分析,用Kaplan-Meier方法分析TTP数据,实验组之间的差异是用log-rank检验来分析,p-PRAS40-Thr246的表达对乳腺癌trastuzumab治疗效果的影响用COX比例风险模型来分析。结果1.乳腺癌组织p-PRAS40-Thr246的表达水平与其临床病理资料之间没有显著相关性。在本研究中,IHC被用于检测p-PRAS40-Thr246在HER2阳性乳腺癌组织中的表达,用于IHC的p-PRAS40-Thr246抗体的特异性及适用性已经被以往的研究所证实。结果如图1所示,p-PRAS40-Thr246在乳腺癌细胞的胞浆中不同强度地广泛表达,并且偶尔在核内表达。根据以往的研究,p-PRAS40-Thr246阳性表达的标准是H评分≥100。运用此标准,共有22例(40%)HER2阳性的乳腺癌被定义为p-PRAS40-Thr246阳性。这些患者p-PRAS40-Thr246的表达水平与其年龄、组织学分级、雌孕激素受体情况等临床病理资料之间没有显著相关性(见表1)。2.乳腺癌组织p-PRAS40-Thr246的表达水平与PI3K-AKT信号通路激活状态之间有显著相关性。本实验对入组的HER2阳性乳腺癌的PI3K-AKT通路的激活状态进行了检测。结果显示,PTEN的缺失在HER2阳性乳腺癌组织中占34.5%(19/55),PIK3CA基因的突变占18.2%(10/55)。另外,在本实验发现的PIK3CA基因突变中,包括7例外显子20的突变(H1047R)及3例外显子9的突变(E542K and E545K),这些都与文献记载的突变情况相一致。根据文献建立的标准,患者被分为P13K-AKT激活状态(PIK3CA突变或PTEN低表达；n=27)和P13K-AKT未激活状态(PIK3CA基因突变类型和PTEN高表达；n=28)。本实验结果显示,p-PRAS40-Thr246的表达与PI3K-AKT信号通路激活状态、单独的PTEN缺失之间有显著相关性,但与单独的PIK3CA突变之间无显著相关性。这些提示了p-PRAS40-Thr246的表达与PI3K-AKT信号通路激活状态之间,有显著的相关性(见表2)。3. P-PRAS40-Thr246可能是一种新型的预测乳腺癌trastuzumab治疗效果的分子标记物。应用Kaplan-Meier方法绘制HER2阳性乳腺癌患者的生存曲线(见图2),在经过trastuzumab治疗后,p-PRAS40-Thr246阳性的患者比那些p-PRAS40-Thr246阴性的患者有着更短的TTP。单变量回归分析被用于确定疾病进展与HER2阳性乳腺癌trastuzumab治疗前PI3K-AKT通路激活状态的关系,PIK3CA基因突变和／或PTEN缺失的患者与其他患者相比,在疾病进展方面有更高的风险。单变量回归分析还显示,患者组织学分级情况也对患者的总体生存时间有影响。以上各影响因素均同时进入多因素回归分析,结果显示,p-PRAS40-Thr246阳性是HER2阳性乳腺癌疾病进展的一个有意义的独立预后因子(表2,HR 2.081；95%的可信区间,1.113-3.890；P=0.022),它能够预测乳腺癌trastuzumab治疗的效果。结论通过临床标本检测及相关病理临床数据的分析,提示P-PRAS40-Thr246在乳腺癌组织中表达,其表达水平与PI3K-AKT信号通路激活状态之间有显著相关性。乳腺癌trastuzumab耐药的发生与p-PRAS40-Thr246有关,P-PRAS40-Thr246是PI3K-AKT通路中导致trastuzumab耐药的关键因子。临床检测p-PRAS40-Thr246可以预测乳腺癌trastuzumab治疗的效果。第二部分PRAS40-Thr246磷酸化在HER2阳性乳腺癌细胞trastuzumab耐药中的作用机制的细胞学研究目的本实验以乳腺癌SKBR3和SKBR3/TDR细胞为研究对象,在细胞水平探讨MK-2206对其杀伤及逆转trastuzumab耐药的作用,验证拮抗p-PRAS40-Thr246的表达能否部分逆转HER2阳性乳腺癌细胞的trastuzumab耐药,为乳腺癌的临床用药提供依据。材料和方法通过诱导的方法建立对trastuzumab耐药的HER2阳性乳腺癌细胞株SKBR3/TDR,以不同浓度的MK-2206处理人乳腺癌SKBR3细胞和SKBR3/TDR细胞,观察MK-2206对SKBR3和SKBR3/TDR细胞的抑制增殖作用。采用CCK-8法检测细胞的耐药倍数和耐药逆转率,观察MK-2206与trastuzumab合用对于SKBR3/TDR细胞的耐药逆转情况,采用FCM法检测细胞凋亡以及trastuzumab的蓄积情况。采用Western blot法检测]p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达。观察MK-2206处理SKBR3和SKBR3/TDR细胞后,对p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达的影响。结果1.CCK-8检测结果提示,不同浓度的trastuzumab和MK-2206均对SKBR3和SKBR3/TDR细胞有抑制增殖的作用,且呈剂量依赖性(图4、图5)。其中trastuzumab对SKBR3和SKBR3/TDR的IC5o分别为(57.32±1.64) ug/ml及(248.24±1.92) ug/ml,耐药倍数为4.33倍。MK-2206对SKBR3和SKBR3/TDR的IC50分别为(40.74±1.66) nmol/L及(43.66±1.43) nmol/L,耐药倍数为1.07倍,提示SKBR3/TDR对MK-2206无耐药性。不同浓度的MK-2206与trastuzumab合用后,SKBR3和SKBR3/TDR的IC50均有不同程度的下降,但以SKBR3/TDR的下降更明显,差异具有统计学意义(P0.01)(结果见表3)。2.FCM检测结果显示,MK-2206可以提高乳腺癌细胞的凋亡率,但不增加trastuzumab的蓄积.Annexin V-FITC双染法结果显示0、2、4、8nmol/L的MK-2206作用于SKBR3和SKBR3/TDR细胞24小时后,均可不同程度提高细胞凋亡率,以SKBR3/TDR提高更明显。实验组凋亡率与对照组相比差异有统计学意义(P0.01)(结果见表4、图6)。FCM法检测SKBR3/TDR细胞内trastuzumab含量结果显示,加入浓度为0、2、4、8、16nmol/L的MK-2206后,细胞的荧光强度分别为(2980±14.57)、(3400±16.78)、(3000±12.49)、(2800±10.74)、(3800±18.40)。各实验组与对照组之间差异没有统计学意义(P0.05)(图7)。提示MK-2206不增加trastuzumab在SKBR3/TDR细胞内的蓄积。3. Western Blot检测结果显示MK-2206可以下调p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达。与对照组相比,不同浓度的MK-2206处理SKBR3/TDR和SKBR3细胞后,均可以下调p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达,且呈剂量依赖性(图8、图9),实验组与对照组之间差异有统计学意义(P0.01)。结论通过细胞学实验结果提示,MK-2206可以下调p-PRAS40-Thr246的表达,抑制p-PRAS40-Thr246可以逆转乳腺癌对trastuzumab治疗的耐药,提高其对trastuzumab的敏感性,可以作为对SKBR3/TDR细胞的一种逆转方案。第三部分乳腺癌trastuzumab耐药裸鼠模型的建立及通过拮抗PRAS40-Thr246磷酸化逆转trastuzumab耐药的体内研究目的体外研究表明,SKBR3/TDR的耐药与PI3K-AKT通路的激活有关,AKT特异性抑制剂MK2206与trastuzumab的联合应用能有效逆转细胞耐药并增强细胞凋亡。是一种潜在的治疗方案。为了进一步验证其有效性及安全性,我们在裸鼠模型上做了相似的体内研究。本部分实验旨在研究,通过拮抗PRAS40-Thr246磷酸化,逆转治疗裸鼠皮下种植性trastuzumab耐药乳腺癌的疗效,为trastuzumab耐药乳腺癌的治疗提供新的思路。材料和方法雌性裸鼠60只,适应性喂养1周。于裸鼠腋窝皮下注射SKBR3/TDR细胞悬液。成瘤后(150mmm3左右)随机分4组(n=4)即SKBR3/TDR空白对照组、SKBR3/TDR应用trastuzumab治疗组、SKBR3/TDR应用MK-2206治疗组、SKBR3/TDR应用trastuzumab及MK-2206联合治疗组。trastuzumab溶于生理盐水中,按4mg/kg腹腔注射,5次/周；MK-2206溶于30%环糊精中,按120 mg/kg灌胃口服给药,3次/周；对照组给予同体积的生理盐水腹腔注射及灌胃口服30%环糊精溶液。肿瘤大小用卡尺测量,计算公式为V(mm3)=π/6 x长径x(短径)2。连续观测20天,20天后切下肿瘤称重,组织用-80℃保存,western-blot检测目的蛋白的表达。结果1.生长状况：向裸鼠腋窝皮下注射5×106 SKBR3/TDR细胞悬液,3周后裸鼠成瘤(如图10、图11、图12、图13、图14所示),经过潜伏期后,裸鼠腋窝皮下接种部位可见灰白色结节,肿瘤呈圆形或椭圆形生长,每5天测量1次肿瘤体积大小。2拮抗PRAS40-Thr246磷酸化能够减缓裸鼠乳腺肿瘤的生长,对肿瘤生长有明显抑制作用。PRAS40-Thr246磷酸化抑制剂与trastuzumab联合应用,可有效逆转裸鼠乳腺癌的trastuzumab耐药,是一种潜在的有效安全的乳腺癌治疗方案。Trastuzumab减缓肿瘤生长不明显,与对照组相比差异不明显。MK-2206单独治疗组可减缓肿瘤生长,但肿瘤仍然增长明显。相反,trastuzumab与MK-2206联合治疗组可明显抑制肿瘤生长,并可相对减小肿瘤体积(如图15、表5所示),差异具有统计学意义。除此之外,裸鼠能耐受药物治疗,治疗期间并未出现裸鼠死亡或体重明显下降等情况,而只是出现瘤体体积的变化。20天后处死裸鼠取瘤,称瘤体后发现：联合治疗组与对照组相比瘤重明显减少,差异有统计学意义,而单独用药组与对照组相比有一定程度瘤重减轻,但减少不明显(如图16、表6所示)。3. Western-blot实验结果显示,MK-2206及Trastuzumab联合治疗可以下调裸鼠乳腺癌组织中p-PRAS40-Thr246和p-AKT-Thr308蛋白的表达(如图17所示)。此外,与对照组相比,单独应用MK-2206能够降低p-AKT-Thr308蛋白和p-PRAS40-Thr246的表达量,但单独应用trastuzumab并未下调PRAS40的磷酸化。对照组与实验组之间的差异有统计学意义(P0.01)。这些结果表明了联合应用trastuzumab和MK-2206的有效性。结论通过建立裸鼠HER2阳性乳腺癌模型及相关动物实验,结果提示：拮抗p-PRAS40-Thr246能够减缓裸鼠乳腺肿瘤的生长,对肿瘤生长有明显抑制作用。MK-2206与trastuzumab联合应用可以下调p-PRAS40-Thr246。P-PRAS40-Thr246抑制剂与trastuzumab联合应用,可有效逆转裸鼠乳腺癌trastuzumab耐药。P-PRAS40-Thr246是一个新型的乳腺癌治疗靶点,为逆转trastuzumab耐药的研究提供帮助。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

【共引文献】