【摘要】：肺癌的发病率和死亡率居全世界人类肿瘤之首。根据病理组织学分类,肺癌可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC),其中又以NSCLC最为多见,约占肺癌总数的80%,NSCLC包括腺癌、鳞癌和大细胞癌等。虽然近年来NSCLC的诊断治疗取得了长足的进步,尤其是分子靶向药物等治疗获得了可喜的成绩,但是仍有70%的NSCLC患者在确诊肺癌的时候已经处于晚期并存在远处转移,这部分病人的5年生存率仅为15%。因此,为提高NSCLC患者的5年生存率必须克服远处转移这一难题。目前我们对肿瘤远处转移的机制仍知之甚少,仍需深入研究探讨,这将对减少NSCLC患者转移复发、延长生存时间、提高生活质量具有重要意义。肿瘤的发生发展及远处转移与肿瘤细胞所处的肿瘤微环境密切相关,其中细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肿瘤转移中具有重要意义。ECM在维持细胞组织稳态和肿瘤细胞侵袭迁移方面至关重要。容易出现早期转移的肿瘤常常通过多种ECM降解蛋白酶如:基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)来提高肿瘤侵袭性。近年来大量研究发现解聚素金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteases,ADAMs)分子结构与MMPs家族具有高度同源性,因此我们猜想ADAMs家族成员可能影响肿瘤侵袭转移。ADAMs属于蛋白酶家族,通过降解ECM和膜结合前体分子来改变细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的状态。根据位置分布可将ADAMs分为:膜型ADAM和分泌型ADAM,分泌型ADAM又称为含Ⅰ型血小板反应蛋白的解聚素金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondinmotifs,ADAMTS)。目前已在多种肿瘤中发现ADAMTS高表达,并且可通过降解ECM提高肿瘤细胞侵袭性和转移性。如ADAM-8、ADAM-12、ADAM-15和ADAM-28在NSCLC中高表达,ADAM-9和ADAM-12在乳腺癌中高表达,ADAMTS4和ADAMTS5在胶质母细胞瘤中高表达。ADAMTS5是蛋白酶家族中的新成员,已被证实在胶质母细胞瘤肿瘤细胞株和肿瘤组织中高表达,有利于肿瘤的发生发展和复发转移,但其生物学作用机制仍需进一步探索。本研究将通过检测ADAMTS5在NSCLC组织和细胞株中的表达水平,结合体外细胞系研究,通过小干扰技术,探讨ADAMTS5在NSCLC中表达的临床意义以及ADAMTS5在NSCLC发生发展及复发转移中的可能的作用机制。目的:研究ADAMTS5在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达情况,首先比较分析ADAMTS5的表达在NSCLC患者癌组织和癌旁正常肺组织的表达差异;其次研究分析ADAMTS5的表达与NSCLC患者临床病理参数之间的相关性以及ADAMTS5对NSCLC患者生存、预后的影响。在细胞水平,研究ADAMTS5对NSCLC细胞生物学行为的影响,分析其发挥作用的具体分子机制,探讨ADAMTS5与NSCLC发生发展的关系,及在NSCLC进程中的影响,探索发现NSCLC的新的肿瘤标志物,研究提高NSCLC治疗效果的新靶点。方法:(1)收集8对成对的新鲜NSCLC患者术后癌组织和癌旁正常肺组织,匀浆后提取蛋白质,使用免疫印迹分析实验法(Western blot,WB),在组织水平检测ADAMTS5在肺癌组织和癌旁正常肺组织中蛋白的表达差异。收集3种NSCLC细胞(A549、H1299和Spca-1),提取细胞蛋白后使用免疫印迹分析实验法,检测在细胞水平ADAMTS5蛋白的表达水平差异。(2)收集2007.01-2010.01期间手术切除的140例NSCLC组织标本,设计调查表,登记每位患者的临床和病理相关资料,包括性别、年龄、手术时间、肿瘤大小、病理组织类型、分化程度、淋巴结转移情况和TNM分期等,同时对患者预后及5年生存时间进行随访。使用免疫组织化学染色实验法(immunohistochemistry,IHC)检测140例石蜡组织切片中ADAMTS5蛋白的表达情况。回顾性调查研究ADAMTS的表达与140例NSCLC患者各项临床病理参数间的关系。统计并使用卡方检验法分析ADAMTS5蛋白的表达程度与NSCLC患者各项临床病理参数之间的相关性;使用COX多因素分析各项临床病理参数、ADAMTS5对患者预后的影响;使用Kaplan Meier生存曲线分析ADAMTS5蛋白的表达对于患者生存预后的影响情况。(3)采用针对ADAMTS5的短发夹sh RNA(short hairpin RNA,sh RNA)干扰质粒,通过脂质体转染法将ADAMTS5-sh RNA转染至ADAMTS5高表达的肺癌细胞株中,建立ADAMTS5基因沉默的肺癌细胞株,检测干扰效率,挑选效果最好的靶点进行后续实验。通过划痕实验(Wound healing assays)、Transwell小室模型实验检测ADAMTS5对肺癌细胞株体外迁移能力的作用。(4)采用免疫印迹实验法检测实验组和对照组中E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)蛋白的表达水平趋势和两者的关系,检测ADAMTS5影响肺癌侵袭转移的分子机制。结果:(1)在8组成对的NSCLC癌组织和癌旁正常肺组织中,癌组织中ADAMTS5蛋白表达显著高于癌旁正常肺组织(p0.01,具有统计学意义);在癌旁正常肺组织中,ADAMTS5均为低表达。选取三株NSCLC细胞株(A549,H1299和Spca-1),免疫印迹实验法检测提示在三株NSCLC细胞株中,ADAMTS5蛋白高表达。免疫荧光提示ADAMTS5主要分布于细胞浆和细胞外基质中。(2)通过免疫组化实验法在140例NSCLC患者石蜡切片组织中检测ADAMTS5的表达情况,发现ADAMTS5主要分布于细胞浆和细胞外基质中。其中79例(56.4%)的患者组织切片高表达ADAMTS5,61例(43.6%)的患者组织切片ADAMTS5低表达。并且可以发现ADAMTS5蛋白在NSCLC组织中高表达程度与淋巴结转移(p0.001)和组织病理分化程度(p0.001)呈正相关,即NSCLC患者伴有淋巴结转移的患者ADAMTS5表达呈强阳性,而无淋巴转移的患者ADAMTS5表达呈弱阳性;在分化程度较差的NSCLC患者中ADAMTS5蛋白表达明显高于分化程度相对较好的NSCLC患者。通过回顾性研究发现,ADAMTS5的表达与性别(p=0.043)、淋巴结转移(p0.001)、临床分期(p=0.036)和组织病理分化(p0.001)等临床病理因素显著相关,具有统计学意义,而与吸烟和是否存在远处转移无显著相关性。(3)Kaplan Meier生存曲线结果表明,ADAMTS5高表达的病例预后情况较低表达的病例差,其5年生存率低于ADAMTS5低表达的患者(p0.001),ADAMTS5可能是预测患者复发风险的指标。临床病理参数单因素生存分析显示肿瘤最大径≥3cm的患者中位生存时间短于肿瘤最大径3cm的患者(p=0.001),伴有淋巴结转移的患者中位生存时间较无转移患者短(p0.001),肿瘤低分化的患者的中位生存时间短于分化相对较好的患者(p0.001)以及ADAMTS5高表达的患者中位生存时间短于低表达的患者(p0.001)。另外,COX多因素回归分析结果示:性别、肿瘤大小、组织分化、分期和ADAMTS的表达情况与NSCLC的预后相关,是NSCLC独立的预测因素。(4)通过小干扰sh RNA技术沉默ADAMTS5基因,发现在转染了ADAMTS5-sh RNA的NSCLC细胞株A549中,ADAMTS5蛋白低表达。划痕实验、Transwell侵袭迁移实验示ADAMTS5基因沉默后,NSCLC肿瘤细胞侵袭迁移能力显著减弱。(5)通过小干扰sh RNA技术沉默ADAMTS5基因后,发现细胞质间粘附蛋白降解标志物(E-cadherin)表达增加,波形蛋白(vimentin)表达降低,NSCLC肺癌粘附蛋白降解减少,侵袭迁移力减弱。结论:(1)ADAMTS5在NSCLC中起促癌作用,在NSCLC组织中高表达与肿瘤淋巴结转移、临床分期和组织病理分化呈正相关;在NSCLC中,ADAMTS5高表达的患者预后比低表达患者预后差;提示ADAMTS5高表达对NSCLC的发生发展、复发有促进作用。(2)ADAMTS5参与NSCLC侵袭转移,可能通过降解细胞外基质、细胞外粘附蛋白等发挥作用;干扰ADAMTS5,NSCLC细胞侵袭迁移力抑制;针对ADAMTS5及其相关信号途径的生物学靶向性干预,ADAMTS5可能为NSCLC特异性治疗提供新策略。
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【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
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本文编号：
2494492
