miR-10a调控结肠癌细胞转移的作用分子机制研究

发布时间：2019-06-09 15:20

【摘要】：【目的】结直肠癌(colorectal cancer)是一种常见的消化道恶性肿瘤,其转移是影响结肠癌患者生存率的主要因素之一,但其转移机制尚未阐明。本课题旨在探讨microRNA(miRNA)在结肠癌侵袭转中的作用与分子机制:1.比较从同一结肠癌患者原位癌和淋巴结转移癌组织分别建立的细胞系SW480和SW620的生物学特性(迁移、粘附和失巢凋亡抵抗)的差异及相关的上皮间质转化(EMT)标志物、粘附和凋亡相关的蛋白分子的表达差异,以确定两种细胞系可作为结肠癌转移的研究模型;2.筛选并鉴定两细胞中差异表达明显的miRNA,分析其在结肠癌组织样本中的表达水平与转移的相关性;分析该miRNA对SW480和SW620细胞增殖、迁移、粘附及失巢凋亡抵抗等转移相关的生物学特性及相关蛋白分子的影响;在动物模型明确该miRNA对结肠癌细胞体内转移的调控作用;3.寻找并鉴定该miRNA与转移功能相关的靶基因,确定靶基因对结肠癌细胞迁移、粘附、失巢凋亡抵抗以及相关蛋白分子的调控作用,阐明该miRNA通过靶基因调控结肠癌转移的分子机制。【方法】1.采用Transwell迁移实验、细胞粘附实验及流式细胞术检测SW480和SW620细胞迁移、粘附和失巢凋亡抵抗的生物学特性,通过Western blot检测二者中E-cadherin、vimentin、β-integrin和Bcl-2的蛋白水平。2.选择本室前期利用miRNA表达谱芯片筛选二者中差异表达的miRNA,并通过RT-qPCR验证上述表达差异;利用RT-qPCR法检测结肠原位癌及相应淋巴结转移癌组织中差异最明显的miRNA水平,将其表达差异与临床病理资料作统计学相关性分析;采用细胞增殖实验、Transwell迁移侵袭实验、细胞粘附实验、流式细胞术及Western blot检测封闭和过表达该miRNA对SW480细胞迁移、粘附和失巢凋亡抵抗能力及E-cadherin、vimentin、β-integrin和Bcl-2蛋白表达的影响。利用裸鼠实验研究体内该miRNA对SW620细胞形成转移瘤的影响。3.应用生物信息学结合双荧光报告载体实验、RT-qPCR和Western blot实验筛选并验证该miRNA的靶基因及对靶基因的调控作用。此外,RT-q PCR和免疫组织化学分别检测靶基因在结肠癌组织中的mRNA及蛋白表达,将原位癌与淋巴结转移癌组织中的靶基因与鉴定的miRNA表达差异作统计学相关性分析;利用细胞迁移实验、粘附实验、流式细胞术和Western blot检测敲降和过表达靶基因对结肠癌细胞迁移、粘附、失巢凋亡抵抗能力及β-integrin、Bcl-2蛋白表达的影响。【结果】1.与SW620细胞相比,SW480细胞具有较强的迁移能力、较弱的细胞粘附和失巢凋亡抵抗能力以及低表达的E-cadherin、β-integrin和Bcl-2分子。2.miR-10a在结肠原位癌细胞(SW480)和组织中的表达明显高于淋巴结转移癌细胞(SW620)和组织(P0.05),其在结肠原位癌与淋巴结转移癌组织的表达差异与肿瘤的转移距离和浸润深度呈负相关(P0.05);封闭miR-10a抑制结肠癌细胞SW480迁移、促进粘附和失巢凋亡抵抗。Western blot结果显示封闭miR-10a抑制SW480细胞EMT、促进β-integrin和Bcl-2表达,过表达miR-10a具有相反作用。裸鼠实验结果显示,miR-10a抑制SW620细胞肝转移瘤形成(P0.05)。3.生物信息学分析结合双荧光报告载体实验、RT-qPCR与Western blot实验证实miR-10a靶定基质金属蛋白酶(MMP14)和肌动蛋白-γ(ACTG1)的3’UTR并负向调控其表达。RT-qPCR和免疫组织化学结果表明MMP14和ACTG1在原位癌与淋巴结转移癌组织中mRNA表达差异分别与miR-10a表达差异呈负相关(P0.05);过表达MMP14和ACTG1促进SW480细胞迁移和粘附(P0.05);敲降MMP14和ACTG1表达,抑制SW480细胞粘附(P0.05),与β-integrin蛋白表达水平降低有关。敲降MMP14和ACTG1降低SW620细胞的失巢凋亡抵抗能力(P0.05),过表达MMP14和ACTG1增强SW620细胞抵抗失巢凋亡的能力(P0.05),分别与β-integrin和Bcl-2蛋白表达升高和降低有关(P0.05)。【结论】1.SW480与SW620细胞代表结肠癌转移发展进程的不同阶段,存在转移相关的生物学特性差异。2.miR-10a通过促进EMT和失巢凋亡促进结肠癌细胞迁移和侵袭、抑制粘附和抗失巢凋亡,最终抑制结肠癌细胞体内转移。3.MMP14和ACTG1为miR-10a负向调控的直接靶基因,二者通过正向调控β-integrin和Bcl-2表达发挥促进结肠癌细胞迁移、粘附和失巢凋亡抵抗的作用。本研究为阐明结肠癌转移的机制提供了新的实验依据及分子途经,为结肠癌的治疗提供了可能的新靶点。
[Abstract]:[Objective] To study the role and molecular mechanism of microRNA (miRNA) in the invasion and metastasis of colon cancer. [Methods] 1. The protein levels of E-cadherin, vimentin, HCO3-integrin and Bcl-2 in SW480 and SW620 cells were detected by transwell migration experiment, cell adhesion test and flow cytometry. [Results] 1. The expression of SW480 cells in colorectal cancer cells (SW480) and tissue was significantly higher than that of SW620 cells (P0.05). [Conclusion] 1.SW480 and SW620 cells represent different stages of the progression of colon cancer metastasis, and there are different biological characteristics of metastasis.2. miR-10a promotes the migration and invasion of colon cancer cells by promoting EMT and the apoptosis, and finally inhibits the in vivo transfer of colon cancer cells.3. MMP14 and ACTG1 are the direct target genes for the negative regulation of miR-10a. Both of them play a role in promoting the migration, adhesion and apoptosis resistance of colon cancer cells by forward and control of the mechanisms of human colon cancer metastasis. The study provides a new experimental basis and molecular route for elucidating the mechanism of colon cancer metastasis, and provides a possible new target for the treatment of colon cancer.
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.3

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本文编号：2495652