半胱氨酸蛋白酶RECK启动子甲基化在骨肉瘤的转移发生过程中的作用及机制研究

发布时间：2019-07-09 16:50

【摘要】：1研究背景骨肉瘤(osteosarcoma)是起源于原始的成骨间充质细胞的常见的原发恶性骨肿瘤,在原发性恶性骨肿瘤中居前三位,多发生于儿童及青年人。发生部位绝大多数为四肢长管状骨干骺端,尤其是股骨远端、胫骨近端和肱骨近端,另外还可发生于颅骨、下颌骨和骨盆,较少发生于肋骨。在1999年到2008年,美国共发现有7104例骨肉瘤患者,该病已经成为儿童及成人肿瘤相关死亡的第二大主要原因。骨肉瘤恶性程度高,进展迅速,在上世纪70年代之前,仅有单一外科手术治疗,其5年生存率仅有15%-20%,大约有80%的病人死于肿瘤转移,主要是肺部转移。近年来,尽管骨肉瘤诊断及放化疗治疗手段取得了较大进步,但由于其高转移率以及手术切除后高复发率,导致患者5年预后仍较差,并且有较高的致死率和致残率。骨肉瘤作为一种具有高度侵袭性的肿瘤,有近20%的患者在就诊时即发生转移,而最常见的转移部位就是肺脏。在疾病的晚期阶段,大约有50%的患者发生致死性肺部转移。既往研究显示非转移骨肉瘤患者生存率为50%-78%,而转移患者生存率仅为10%-20%。因此,骨肉瘤的转移侵袭机制也越来越多的成为研究的重点,深入探讨其转移侵袭机制对于加深骨肉瘤的认识及寻找新的干预靶点和治疗措施具有重要意义。恶性肿瘤最主要的病理生理学特点即为侵袭和转移,这是导致疾病预后差的根本原因。所谓侵袭是指恶性肿瘤细胞侵入肿瘤周围正常组织并生长增殖的现象；而转移(metastasis)是指肿瘤细胞脱离原发肿瘤灶进入周围的血管或者淋巴管,随血液和淋巴液播散至靶器官,肿瘤细胞侵出管脉系统并在靶器官滞留,通过逃避自身机体的免疫破坏而在靶器官处增殖形成新的肿瘤病灶。侵袭不仅是导致术后肿瘤复发的根本原因,也是肿瘤转移的关键。研究发现肿瘤细胞分泌MMPs、丝氨酸蛋白酶及半胱氨酸蛋白酶分解基底膜,脱离原位肿瘤组织,而肿瘤细胞通过显著增加络氨酸激酶受体(TrkB)、整合素对α2β3、腺瘤息肉病杆菌(APC)基因产物、黏着斑激酶、半乳凝素-3以及转移生长因子(transforming growth factor-β, TGF-β)等蛋白直接抵抗失巢凋亡,帮助细胞远处转移。到达远隔部位后,肿瘤细胞形成的瘤栓粘附于内皮细胞进而穿过基底膜。在该过程中,整合素和层粘连蛋白受体以及蛋白水解酶发挥了重要作用。另外,血管生成是肿瘤转移的关键步骤,其机制是促血管生成因子(VEGF, FGF,IL-18)与其拮抗因子(血小板反应蛋白-1,血管抑素,乳腺丝抑蛋白)失衡,导致内皮细胞增殖进而生成血管。由上可见,多种基因及其产物参与了骨肉瘤的侵袭转移,其中,整合素、TGF-β、VEGF及MMPs在其中发挥了重要作用。整合素可以直接或间接的促进肿瘤细胞向上皮间质转化,而上皮间质转化现象与肿瘤的侵袭转移密切相关；整合素也可以激活VEGF信号通路诱导肿瘤血管生成；TGF-β可抑制全身免疫协助肿瘤细胞逃避宿主免疫监视,并能调节肿瘤微循环中免疫细胞浸润；TGF-β可通过smads,MAPKs,Ras等信号通路以及多种microRNA促进细胞转化和新生血管生成。MMPs可降解多种细胞外基质成分,促进肿瘤细胞的侵袭转移。一些研究揭示了骨肉瘤发生转移的相关分子机制。埃兹蛋白被认为是转移决定因子,其高表达预示骨肉瘤患者预后较差。另外,肝素酶、磷酸酶-张力蛋白类似物(PTEN)以及神经黏连因子-2也参与介导骨肉瘤的转移。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组蛋白水解酶,可通过降解细胞外基质,促进肿瘤细胞的局部浸润及远处转移。大量研究发现MMP-2和MMP-9在骨肉瘤转移过程中发挥重要作用。在正常组织中,MMP-2的表达受到如MMP组织抑制因子(TIMP)、有Kazal模体、可逆调节的半胱氨酸富集蛋白(RECK)、a2巨球蛋白等天然抑制因子的抑制；而在骨肉瘤组织中,MMP-2的表达明显上调。研究发现MMP-2阳性的骨肉瘤患者生存时间及生存率均显著低于阴性患者,且Cox生存分析显示MMP-2与预后密切相关。MMP-9在骨肉瘤组织中也呈现过表达状态,研究发现抑制其mRNA水平及蛋白活性,可显著减少人骨肉瘤细胞的浸润和侵袭。骨肉瘤组织中MMP9的过表达与RECK的减少密切相关。RECK,最初是从cDNA表达克隆分离出来的转化抑制基因,通过编码GPI锚定的糖蛋白下调或抑制MMPs,因此,被认为是MMPs内源性抑制因子。近年来研究发现,在鼻咽癌、胶质瘤、膀胱癌、非小细胞性肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肝细胞癌及前列腺癌等多种肿瘤细胞中,RECK的mRNA及蛋白表达显著下调。研究发现在结肠癌、胃癌、肝癌以及肺癌组织中,RECK超甲基化现象预示患者预后较差。这些研究结果提示RECK可能通过抑制MMPs进而抑制肿瘤细胞的转移。近年也有研究发现低水平RECK是骨肉瘤预后差的一个独立预测因素。同时,越来越多的研究发现RECK启动子区域的甲基化与肿瘤的发生发展密切相关。研究发现致癌基因RAS能够通过DNA甲基转移酶3b介导的启动子甲基化而使RECK基因沉默,而应用甲基转移酶抑制剂后能够维持RECK的表达并可能抑制肿瘤细胞的侵袭。在非小细胞肺癌中人们也发现RECK在启动子甲基化的影响下表达下调而且这种下调与K-ras基因突变以及淋巴结转移显著相关。在口腔鳞癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中均发现RECK启动子甲基化与肿瘤的侵袭转移有关。综上可见,RECK在肿瘤的发生及侵袭转移过程中发挥重要作用,但是目前较少有文献深入研究RECK在骨肉瘤中的具体作用和机制。我们拟通过搜集正常人及骨肉瘤患者组织标本,探讨不同组织中的RECK的表达情况以及RECK启动子甲基化在骨肉瘤细胞转移中的作用及相关机制。2研究目的(1)探讨正常组织、局部限制性骨肉瘤与侵袭转移的骨肉瘤组织中RECK的mRNA和蛋白质表达水平的差异,探讨TGF-β、VEGF及去甲基化制剂5-氮杂胞苷干预后RECK表达水平的变化；(2)探讨不同组织中RECK启动子区域甲基化水平的差异以及转移性肿瘤标志物表达变化,揭示RECK的作用机制。3实验方法3.1人骨肉瘤组织标本留取骨肉瘤标本取自大于40岁的男性人员,包括15例局部限制性骨肉瘤患者、15例原发骨肉瘤切除(多数为截肢手术)后伴发浸润转移的患者、15例骨组织正常者(标本由非恶性原因所致死亡者尸检所得)。每组随机选取5个样本进行组织提取,所有实验重复三次以检测不同参数变化趋势。3.2骨肉瘤细胞的富集与培养从骨肉瘤组织中提取细胞并培养,用于后续实验。3.3细胞刺激鉴于VEGF和TGF-β在肿瘤发生转移过程中发挥重要的作用,我们VEGF和TGF-β刺激局部限制性骨肉瘤细胞,用以动态观察不同组织细胞内RECK的mRNA及蛋白的表达变化情况；同时,为探讨RECK甲基化在骨肉瘤细胞转移中的作用,我们加用甲基化抑制剂5-氮胞苷与细胞共培养,检测不同组细胞中RECK启动子甲基化平。3.4 RNA提取、逆转录及实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)分别提取正常骨组织细胞、局部限制性骨肉瘤组织细胞、侵润转移的骨肉瘤组织细胞以及分别应用VEGF和TGF-β干预的局部限制性骨肉瘤组织细胞和5-氮胞苷干预的转移性骨肉瘤组织细胞的mRNA,并通过RT-PCR方法检测不同组织细胞内RECK的mRNA水平。3.5 DNA甲基化检测不同组织细胞DNA组提取后应用亚硫酸氢钠修饰基因组DNA,修饰后DNA用于PCR检测RECK启动子甲基化水平。3.6免疫印迹(Western blot)检测提取正常骨组织细胞及转移性骨肉瘤组织细胞总蛋白,行Western blot检测RECK蛋白表达水平。3.7 ELISAELISA用于检测未干预的骨肉瘤组织细胞、正常骨组织细胞以及分别应用VEGF和TGF-β干预的局限性骨肉瘤组织细胞和5-氮胞苷干预的转移性骨肉瘤组织细胞的RECK蛋白表达水平。3.8统计学分析应用SPSS 16.0软件包分析所有实验数据。采用均数±标准差表示计量资料。统计分析采用Oneway ANOVA或LSD post-hoc分析。P0.05被认为差异具有统计学意义。4.结果4.1转移性骨肉瘤组织中RECK mRNA水平降低我们对对照组、局部限制性骨肉瘤组、转移骨肉瘤组、局部限制性骨肉瘤+VEGF组、局部限制性骨肉瘤+TGF-β组、对照+氮胞苷组、转移骨肉瘤+氮胞苷组7个组RECK mRNA表达水平进行比较,结果显示其在转移性骨肉瘤组织细胞中明显降低,5-氮胞苷则能够增加转移性骨肉瘤中RECK mRNA的表达,而VEGF和TGF-β则能够抑制限制性骨肉瘤中RECK mRNA的表达。5-氮胞苷的实验结果间接说明RECK转录水平的变化可能与其启动子甲基化调节有关。4.2转移性骨肉瘤组织中RECK蛋白表达减少我们应用ELISA方法检测了上述各组中RECK的蛋白表达情况,与mRNA水平检测结果相似,在转移性骨肉瘤组织细胞中RECK蛋白的表达也显著减少,组间差异较大,有统计学意义。除ELISA方法外,我们同样进行了western blot检测观察RECK蛋白表达的变化,结果显示与对照组相比,转移性骨肉瘤组RECK蛋白表达显著降低。4.3转移性骨肉瘤组织中RECK启动子甲基化水平增加我们比较了对照组、局部限制性骨肉瘤组、转移骨肉瘤组、局部限制性骨肉瘤+VEGF组、局部限制性骨肉瘤+TGF-P组、对照+氮胞苷组、转移骨肉瘤+氮胞苷组7个组RECK启动子甲基化水平。结果显示,在转移性骨肉瘤组织中,RECK启动子被高度甲基化修饰,VEGF和TGF-β可诱导骨肉瘤细胞呈现高度甲基化的表型,而这种甲基化可被5-氮胞苷所抑制。4.4转移性骨肉瘤组织中相关侵袭小体蛋白标志物增加我们对在肿瘤细胞侵袭转移过程中发挥重要作用的4种蛋白即MMP-9、黏着斑蛋白激酶、β1/β3-整合素进行检测。与其他组相比,转移性骨肉瘤组织中这些蛋白的表达均明显增加。5.结论1.RECK在骨肉瘤组织中表达水平显著下降,尤其是在骨肉瘤转移个体中其下降更为明显,而RECK表达下降的机制为RECK基因启动子区域的甲基化。2.骨肉瘤中,RECK表达下调与肿瘤转移标志物如MMP9、黏着斑激酶、整合素β1和整合素β3的高表达呈相关性,提示RECK能抑制肿瘤转移而其表达下调则激活了骨肉瘤转移。
文内图片：

图片说明：图１．转移性骨肉瘤组织中ＲＥＣＫ邋ｍＲＮＡ水平降低
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738.1

【参考文献】