ADAM10在腺癌细胞中对促凝血相关因子的调节作用

发布时间：2019-07-11 21:34

【摘要】：肿瘤源性血栓形成特指由于明确肿瘤诱因所导致的血栓形成和血栓栓塞。在动脉系统主要要表现为脑中风和心肌梗死,其发病率为1.5%-3.1%不等；而静脉系统受累主要包括深静脉血栓形成和肺动脉栓塞,发病率约有15%-20%,同时近5%的肿瘤患者是在进行其他项目检查时意外发现肺栓塞。肿瘤的发生部位、类型、分期、分级,及治疗方法都会影响肿瘤患者发生静脉血栓的发病率,其中肿瘤类型被认为与发病率的关系最为密切,大量研究表明肺癌,胰腺癌,胃癌,卵巢癌等肿瘤患者较其他肿瘤患者更容易出现静脉血栓,其原因多与腺癌细胞分泌大量黏蛋白等促凝因子相关。目前,静脉血栓形成已经成为癌症患者除去原发肿瘤外的首要死亡原因,是影响肿瘤患者治疗和预后的重要危险因素。由于肿瘤患者同时存在血液高凝状态和凝血功能紊乱,同时肿瘤患者体内的静脉血栓除去血液成分以外还掺杂有肿瘤细胞,因此在接受常规抗凝治疗后,治疗效果并不满意,甚至伴有大出血的风险。因而探明肿瘤诱导血栓形成的具体机制,寻找到新的肿瘤源性静脉血栓治疗方向成为目前的研究热点。肿瘤诱导血栓形成主要包括两方面：一是肿瘤细胞凭借自身的高侵袭性穿过血管内皮屏障进入血液循环系统；二是与血液成分接触的肿瘤细胞通过相关机制调节促凝因子的释放,在引发血栓形成的同时随着血液循环进行远处转移。目前,肿瘤诱导静脉血栓形成的研究焦点已不再集中于半胱氨酸蛋白酶对于直接因子X的激活,而是转向以组织因子相关凝血途径为代表的外源性凝血途径的激活。肿瘤细胞表达的组织因子和粘蛋白被认为在血栓形成过程中起到重要促凝作用。组织因子的大量释放不仅有助于原癌基因的表达和抑癌基因的抑制,同时还协助肿瘤血管生成从而增强肿瘤细胞的侵袭性。去整合素金属蛋白酶(A disintegrin and metalloproteases, ADAMs)是一类具有八个不同结构域的1型跨膜蛋白,因该族蛋白含有金属蛋白酶结构域和去整合素结构域,因此被认为在细胞分化和迁移过程中对于细胞因子和粘附分子的释放起到重要作用。ADAM 17因为对肿瘤相关因子的分泌有促进功能因此已经在肿瘤细胞中得到深入研究,与其结构极为相似的ADAM 10最初在阿尔茨海默症的研究中得到广泛关注,因此其研究多集中在神经和胚胎系统,而在肿瘤领域的研究正逐步展开。本研究将探讨在腺癌细胞系中ADAM 10对于肿癌迁移能力和侵袭性的影响,以及对于相关促凝血因子分泌的调节作用,从而为肿瘤患者静脉血栓治疗新靶点的研究提供理论支持。第一部分ADAM10对腺癌细胞迁移力和侵袭性的调节目的：为了明确ADAM10在mRNA和蛋白水平的降低是否会引起四种腺癌细胞的迁移能力和侵袭性发生相应变化。方法：对人非小细胞肺腺癌细胞系A549,人结直肠腺癌上皮细胞系DLD-1,人乳腺癌细胞系MCF-7和人胰腺导管腺癌细胞系PANC-1四种腺癌细胞进行分组设置,其中进行ADAM10小RNA干扰(Small interfering RNA, siRNA)的细胞为实验组,未经过转染处理的细胞为对照组。首先使用免疫荧光的方法检测目的分子在腺癌细胞中的表达情况：其次分别使用划痕实验检验其迁移能力的改变；[ranswell实验检测其侵袭能力的改变；同时使用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time polymerase chain reaction, Real-Time PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)检测ADAM10,粘蛋白MUCl和VEGFR-2在mRNA和蛋白水平的改变。结果：在免疫荧光结果中,四种腺癌细胞膜表面均可以见到ADAM10, MUC1和VEGFR-2的表达。进行ADAM10 siRNA转染后,四种腺癌细胞实验组较其对照组在迁移能力和侵袭能力方面均减弱。在mRNA水平, ADAM10在PANC-1中表达最多,MUC1在MCF-7中表达最多, VEGFR-2在PANC-1中表达最多；在蛋白水平, ADAM10在A549中表达最高,MUC1在MCF-7表达最高,VEGFR-2在A549中表达最高。ADAM10, MUC1和VEGFR-2在mRNA和蛋白水平的表达在实验组较对照组均有所下降。结论：ADAM10在mRNA和蛋白水平的表达降低能够引起四种腺癌细胞的迁移能力和侵袭能力发生减弱,这种减弱可能与MUC1和VEGFR-2的表达降低相关。第二部分ADAM10对腺癌细胞促凝血因子释放的调节目的：为了明确ADAM 10在mRNA和蛋白水平的降低是否会引起四种腺癌细胞所分泌的促凝血相关因子的表达发生相应变化。方法：将四种腺癌细胞根据是否进行ADAM10siRNA转染分为实验组和对照组。使用免疫荧光的方法检测目的分子在肿瘤细胞中的表达情况；Real-Time PCR和Wsetern Blot方法分别检测ADAM 10, PSGL-1和TF在mRNA和蛋白水平的改变。结果：在免疫荧光结果中,四种腺癌细胞中均可以见到ADAM 10, PSGL-1和TF在细胞膜表面表达。进行ADAM 10 siRNA转染后,在mRNA水平,ADAM 10在PANC-1中表达最多,PSGL-1在PANC-1中表达最多,TF在DLD-1中表达最多：在蛋白水平,ADAM 10在A549中表达最高,PSGL-1在PANC-1表达最高,TF在A549中表达最高。在Real-Time PCR和Wsetern Blot结果中,经过转染处理后的实验组中所有目的分子的表达均较对照组有所下降。结论：ADAM 10在mRNA和蛋白水平的表达降低能够引起四种腺癌细胞所分泌的凝血相关因子PSGL-1和TF的表达相应减少,这种调控与肿瘤源性静脉血栓形成中的高凝状态改变相关。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2

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