结直肠癌hTERT调控相关miRNA的筛选与初步鉴定

发布时间：2019-07-12 07:03

【摘要】：结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是第三位常见恶性肿瘤,且发病率总体呈上升趋势。临床上CRC多是进展期患者,虽联合化疗、靶向药物治疗、放疗、外科手术等综合治疗手段,总体生存仍不满意。CRC的发生发展与包括端粒酶等诸多肿瘤相关因子的异常表达及功能改变有关。深入研究这些肿瘤相关因子对了解CRC的发病机制、影响预后的因素及治疗策略的选择具有重要意义。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是一种特殊的逆转录酶,特异地以h TR为模板,并将其转录为端粒DNA重复序列,是端粒酶复合物的催化亚基,是端粒酶活性调节的限速亚单位。研究发现,hTERT参与CRC的发生、侵袭转移过程,与大肠癌患者淋巴结转移、TNM分期及术后生存时间密切相关。因此了解hTERT在CRC中的转录调控机制对于了解CRC的发病机制以及探寻特异性端粒酶抑制剂有重要意义,但目前hTERT转录调控机制仍尚未清楚。micro RNA(miRNA)是一类真核生物中新发现的长度约为(18-24)nt的内源性非编码单链RNA。它通过抑制mRNA的翻译或降解mRNA,从而在转录后水平抑制靶基因的表达,在细胞增殖、分化、凋亡、基因调控及肿瘤的发生中具有重要作用。目前仅发现3个miRNA(mi R-138、mi R-1266、mi R-1207-5p)参与了hTERT在甲状腺癌、胃癌中转录后调控,而在大肠癌中还未曾有研究报道。由于miRNA对同一靶基因的调控在不同类型的肿瘤中可能存在差异;另外miRNA对靶基因的调节并非完全配对结合,一条miRNA可以调控多个靶基因表达,而一个基因亦可同时受多条miRNA调控。我们推测在CRC中可能存在其他miRNA对hTERT的调控。本研究将分四部分,第一部分采用q RT-PCR技术检测CRC组织中hTERT mRNA的表达情况,观察hTERT mRNA与CRC临床病理因素的关系;第二部分采用生物信息学技术,通过检索基因表达综合数据库,获得可能调控hTERT的候选miRNA;第三部分采用q RT-PCR技术检测候选miRNA在CRC组织中的表达情况,并观察候选miRNA与CRC临床病理因素的关系;第四部分采用western blot技术检测CRC组织中hTERT蛋白表达情况,并分析可能调控hTERT的miRNA与hTERT蛋白的相关性,为下一步印证和鉴定调控hTERT的miRNA打下基础。第一部分hTERT mRNA在结直肠癌组织中的表达及其临床意义目的探讨hTERT mRNA与CRC各临床病理因素的关系以及在判断CRC预后的意义。方法采用实时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)法检测84例CRC组织中hTERT mRNA的表达,结合临床参数及随访获得的资料进行分析。结果1.84例标本中,20例hTERT在CRC组织中表达下调(RQ1),64例表达上调(RQ1),高表达率为76.19%。2.与无淋巴结转移结直肠癌相比,有淋巴结转移的结直肠癌中hTERT高表达率明显增高,差异具有统计学意义(92%vs 52%,P=0.011);与结直肠癌临床TNM分期Ⅰ/Ⅱ期相比,Ⅲ/Ⅳ期中hTERT高表达率明显增高,差异具有统计学意义(92.3%vs 50%,P=0.006),但hTERT mRNA高表达水平与CRC患者的年龄、肿瘤的大小、分化程度、肿瘤部位及浸润深度和远处转移之间均无显著性相关(P值均0.05)。3.结直肠癌患者hTERT mRNA阳性组与阴性组之间总生存期生存曲线具有统计学差异(P=0.014)。结论hTERT mRNA在CRC组织中的表达明显高于正常组织,并与CRC患者的TNM分期、淋巴结转移及术后生存时间显著相关,说明了hTERT在CRC发生、发展中可能起重要作用。第二部分hTERT调控相关miRNAs的筛选目的基于表达谱芯片数据分析和生物信息学手段挖掘与结直肠癌hTERT调控相关的miRNAs。方法根据设定条件在Gene邋Expression邋Omnibus邋(GEO)数据库中下载与CRC相关的miRNA表达谱芯片数据GSE10259,GSE33127,GSE35602,GSE38389,GSE39845,GSE49246,GSE18392,GSE35982。结合文本挖掘及利用mi RWalk在线软件,初步筛选出hTERT调控相关的miRNA。结果获得了8个可能在大肠癌组织中表达下调且与hTERT调控相关的miRNA:mi R-124、mi R-138、mi R-150、mi R-378、mi R-133a、mi R-133b、mi R-29c、mi R-422a。结论通过文本挖掘及mi RWalk在线软件可以初步筛选出高度可能hTERT调控相关的miRNA。第三部分hTERT调控相关的micro RNAs在结直肠癌中的表达及其临床意义目的探讨hTERT调控可能相关的miRNA在结直肠癌及相应正常组织中的表达情况,分析其临床意义。方法采用荧光定量PCR(q RT-PCR)检测84例结直肠癌组织中8个miRNA的表达,并结合临床参数及随访获得的资料进行分析。结果1.miRNA-29c-3p在大肠癌组和相应正常组中的表达差异无统计学意义(P=0.260),而mi R-133a-3p,mi R-133b,mi R-422a,mi R-150-5p,mi R-378a-3p,mi R-124-3p,mi R-138-5p在结直肠癌组中的表达明显低于相应正常组,差异具有统计学意义(P0.05)。2.mi R-133a-3p、mi R-133b、mi R-150-5p、mi R-150-5p、mi R-124-3p的低表达与结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤位置、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及临床分期之间差异均无统计学意义(P0.05)。3.与无远处转移结直肠癌相比,mi R-138-5p在有远处转移结直肠癌的低表达率更高,差异具有统计学意义(88.89%vs 40.91%,P0.000);mi R-138-5p的低表达与结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤位置、分化程度、浸润深度、淋巴结转移以及临床分期之间差异均无统计学意义(P0.05)。4.与无远处转移结直肠癌相比,mi R-378a-3p在有远处转移结直肠癌的低表达率更高,差异具有统计学意义(77.78%vs.42.42%,P=0.008);与结肠癌组相比,直肠癌组mi R-378a-3p低表达率明显增高,差异具有统计学意义(66.67%vs.37.5%,P=0.008)。mi R-378a-3p的低表达与CRC患者的年龄、性别、分化程度、浸润深度、淋巴结转移以及临床分期之间的差异均无统计学意义(P0.05)。5.与无淋巴结转移结直肠癌相比,mi R-422a在淋巴结转移阳性结直肠癌组的低表达率明显增高,差异具有统计学意义(59.26%vs.33.33%,P=0.023);mi R-422a的低表达与结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤位置、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期之间差异无统计学意义(P0.05)。结论7个miRNA(mi R-124-3p,mi R-133a-3p,mi R-133b,mi R-138-5p,mi R-150-5p,mi R-378a-3p,mi R-422a)在结直肠癌组织中表达下调,其中mi R-378a-3p、mi R-138-5p、mi R-422a的表达下调与结直肠癌患者的远处转移或淋巴结转移相关,mi R-422a的表达水平与结直肠癌患者总生存时间密切相关。第四部分miRNAs与hTERT蛋白表达的相关性研究目的探讨上述miRNA与hTERT蛋白表达的相关性,为下一步进行可能靶向调控hTERT的miRNA的相关功能验证研究打下基础。方法采用Western blot技术检测hTERT蛋白表达,结合第三部分7个miRNA的q RT-PCR检测结果,进行相关分析。结果1.62例(注:原84例,实验过程中部分标本丢失)结直肠癌患者hTERT、mi R-422a、mi R-378a-3p、mi R-150-5p、mi R-138-5p、mi R-133b、mi R-133a-3p、mi R-124-3p高表达组与低表达组总生存期生存曲线之间均无统计学差异(P=0.272,P=0.062,P=0.130,P=0.707,P=0.174,P=0.845,P=0.575,P=0.127)。但mi R-422a、mi R-150-5p、mi R-124-3p、mi R-138-5p在高表达组与低表达组之间的生存曲线分开相当明显。2.mi R-124-3p、mi R-150-5p的表达与其他5个miRNA的表达呈正相关,与hTERT蛋白表达无显著相关性(r详见论文第四部分);mi R-133a-3p的表达与mi R-138-5p的表达、hTERT蛋白表达无显著相关性,而与其余5个miRNA的表达呈正相关(r详见论文第四部分);mi R-138-5p与mi R-133a-3p的表达无显著相关性,而其他5个miRNA的表达呈正相关,与hTERT蛋白表达呈负相关(r详见论文第四部分)。mi R-133b、mi R-378a-3p、mi R-422a的表达分别与其他6个miRNA的表达呈正相关,与hTERT蛋白表达呈负相关(r详见论文第四部分)。结论初步认为mi R-422a、mi R-133b、mi R-378a-3p、mi R-138-5p可能参与调节hTERT的蛋白表达。进行这4个miRNA尤其是mi R-422a的相关调控功能的实验研究十分必要。
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图片说明： 图 1-1 hTERT、GAPDH 实时荧光定量 PCR（A）扩增曲线图；（B）溶解曲线图Figure 1-1. hTERT and GAPDH expression in colorectal cancer tissues and normal tissues by qRT-PCR.(A) The amplification curves of hTERT and GAPDH, respectively. (B) The corresponding melting curvesanalysis of hTERT and GAPDH demonstrates single peak.图 1-2：（A）84 例结直肠癌标本相对于正常组织中 hTERT 的表达倍数（-△△CT）；（B）结直肠癌组织和正常组织中 hTERT 的相对表达水平（目的基因 CT 值-内参基因 CT 值）。Figure 1-2: (A) the expression of multiple for hTERT in 42 cases of colorectal cancer specimens relative tonormal tissue (-△△CT); (B) the relative expression levels of hTERT in colorectal cancer group and normal正常组织大肠癌组织
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图片说明： 图 1-1 hTERT、GAPDH 实时荧光定量 PCR（A）扩增曲线图；（B）溶解曲线图Figure 1-1. hTERT and GAPDH expression in colorectal cancer tissues and normal tissues by qRT-PCR.(A) The amplification curves of hTERT and GAPDH, respectively. (B) The corresponding melting curvesanalysis of hTERT and GAPDH demonstrates single peak.
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34

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本文编号：2513529