【摘要】：结直肠癌是一类严重威胁人类健康和生存的恶性肿瘤。据统计,在世界范围内,结直肠癌发病率及死亡率均居恶性肿瘤的第三位[1]。在我国,随着居民生活方式和膳食结构的改变,以及人口老龄化进程的加快,结直肠癌的发病率多年来呈明显上升趋势,多集中于60-74岁的老年人[2]。尽管近年来结直肠癌的早期诊断及治疗手段取得了一定的进步,但中晚期结直肠癌患者的死亡率仍居高不下,而转移和复发是导致死亡率明显增加的重要原因。据2016年最新癌症数据统计,发生远处转移的结直肠癌病人的五年生存率仅为13%[1]。因此,积极开展对结直肠癌转移机制的研究,寻找新的关键分子和治疗靶点,对结直肠癌的干预和治疗具有重大意义。上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)主要是指上皮细胞向间质细胞转化的过程。在这个过程中,上皮细胞逐渐失去上皮表型,如极性的丢失,细胞与细胞间连接消失,上皮标志物表达下调或缺失,继而逐渐获得间质细胞表型,如细胞骨架的重塑,间质标志物的表达增加或获得,细胞的迁移侵袭能力增强等[3,4]。目前普遍认为EMT在结直肠癌的转移中发挥着重要的作用。细胞内外的多种分子和信号通路参与其中,通过与细胞内外的不同分子相互作用,激活胞内不同的信号通路,各种信号通路相互交错形成复杂的网络,调控EMT的发生。其中,NF-κB信号通路,无论在与癌症发生发展密切相关的炎症发展过程,还是在癌症原发灶及转移灶的形成和发展中,都发挥着重要的作用[5,6]。其激活不仅是宿主抵抗感染及压力等所引起的炎症反应的中心环节。在癌症中,NF-κB也可通过上调多种调节细胞生存、增殖、迁移、侵袭的基因,同时对抗生长调节因子如抑癌基因p53等,发挥促进癌症发展的作用[5]。NF-κB下游一系列重要分子,尤其是锌指蛋白snail,参与NF-κB调节的多种癌症的发生发展过程。Snail可受NF-κB的诱导,为在EMT及癌症发生过程中,表达明显上调的多个转录因子之一。其激活后,可明显抑制在癌症EMT及转移过程中发挥核心作用的钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。有研究表明,snail不仅可调控上皮肿瘤细胞及间质宿主细胞的细胞结构,还可调节肿瘤细胞和宿主细胞之间的旁分泌过程及一系列信号通路,进而影响肿瘤转移的过程。因此,在肿瘤细胞中,snail的表达可以促进肿瘤EMT的发生,并为肿瘤干性及运动能力不可或缺的重要特征[7]。脂质运载蛋白2(Lipocalin2,LCN2),又称中性粒细胞白明胶酶-相关脂质运载蛋白(Netrophilgelatinase-associated Lipocalin2,NGAL),最初发现其可通过结合细菌生长所必需的铁离子从而抑制细菌的生长,参与固有免疫反应过程[8]。近年,大量研究表明LCN2在多种肿瘤中表达上调,参与肿瘤形成及转移的过程。但研究报道的其参与肿瘤进展的具体机制仍不清楚。如LCN2可以抑制肝细胞癌的EMT发生及转移,并且可以抑制胰腺癌的侵袭及血管生成;而在前列腺癌和肝癌中,LCN2则可通过调节不同通路从而促进EMT的发生。另外,LCN2还可在细胞内转运视黄醇,近年研究报道,其在细胞内发挥作用的主要形式,全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)参与多种肿瘤的发生发展过程,但其在不同肿瘤中的具体分子机制研究仍不明确。因此,本研究的主要目的是明确LCN2在结直肠癌中EMT发生过程中的作用,并探索具体的分子机制;同时探索ATRA是否在结直肠癌EMT发生过程中发挥作用,其对EMT的作用是否与LCN2有关。为了明确LCN2在结直肠癌EMT及转移中的作用,我们采取将LCN2敲除或过表达的实验方法,从体内及体外两个方面,对EMT相关标志物及生物学行为,进行了验证;并在临床样本中,对LCN2与EMT相关标志物的关系及其对预后的意义进行了分析。我们将构建好的含shRNA-LCN2慢病毒载体,感染LCN2高表达的细胞系SW480和HT29,将含LCN2-CDS区的慢病毒载体感染LCN2低表达的结直肠癌细胞系SW620和RKO,通过real-time qPCR及western blot的方法检测相关指标的mRNA及蛋白水平的变化;划痕实验检测结直肠癌细胞的运动能力改变;CCK8、克隆形成实验检测细胞增殖能力的变化;transwell小室方法检测细胞迁移、侵袭等生物学行为的变化;同时,我们也建立了裸鼠原位移植瘤模型及肺部转移模型,在动物体内观察LCN2对肿瘤生长及转移的影响;最后分析临床样本中LCN2与相关指标的关系,及对结直肠癌病人预后的影响,明确LCN2在结直肠癌EMT中的作用及其临床意义。结果发现,LCN2敲除后可明显下调上皮标志物钙黏蛋白(E-cadherin)的表达,上调间质标志物波形蛋白(vimentin)的表达;增强细胞增殖、迁移、侵袭的能力;过表达LCN2后则抑制了EMT的发生及细胞增殖、迁移、侵袭能力。体内实验也证实,敲除LCN2后肿瘤生长速度、瘤体体积均明显高于转染空载体组,而过表达LCN2后肿瘤的生长则受到明显抑制;肺部转移实验也表明,过表达LCN2后裸鼠肺部转移灶的形成数量明显少于转染空载体组,提示LCN2可抑制结直肠癌中EMT的发生。为了进一步探索LCN2对EMT的抑制作用是否与NF-κB通路有关,我们在敲除或过表达LCN2的细胞系中,检测NF-κB及其磷酸化水平和snail表达变化的基础上,改变NF-κB及snail的活性或表达,观察相应生物学行为的改变及分子水平的表达情况,明确NF-κB/snail信号通路在LCN2调控的EMT过程中的作用。我们发现,敲除LCN2后,NF-κB的磷酸化水平、在细胞核内的聚集及其下游因子snail的表达明显升高,免疫荧光实验结果显示,LCN2敲除后,snail的荧光强度及其在细胞核内的分布明显增强;在过表达LCN2的细胞系中,NF-κB的表达、磷酸化水平及snail的表达则明显降低,snail在细胞核内的聚集及荧光强度明显减弱;荧光素酶报告基因的实验结果也表明,过表达LCN2可明显削弱NF-κB的启动子活性。随后我们选取结直肠癌细胞系SW480及SW620,分别外源加入20nM的NF-κB激活性leptomycinB(LMB)及50nM的NF-κB抑制剂Bay11-7082,检测NF-κB对结直肠癌EMT相关指标的影响。结果表明,NF-κB可明显下调E-cadherin的表达,上调vimentin及snail的表达,表明NF-κB在结直肠癌中促进EMT的发生。以上结果提示,NF-κB/snail信号通路可能在LCN2调节的EMT中发挥作用。为了进一步探讨NF-κB/snail信号通路在LCN2调节的EMT中可能发挥的作用,我们分别通过在敲除LCN2的SW480细胞系中外源加入0.05nM sip65减弱NF-κB表达,在过表达LCN2的SW620细胞系中外源加入NF-κB激活剂LMB增强其表达,及转染snail的过表达质粒恢复snail的表达,来明确LCN2是否可通过调节NF-κB/snail信号通路,发挥抑制结直肠癌EMT的作用。我们同样采用real-time qPCR及western blot方法,检测EMT相关指标的变化。结果显示,在LCN2敲除的细胞系SW480中,NF-κB的干扰可上调LCN2敲除引起的E-cadherin、ZO-1的下降,下调LCN2敲除诱发的vimentin及snail表达的上调;而在LCN2过表达的SW620细胞系中,恢复下降的NF-κB的表达后,则明显逆转过表达LCN2引起的E-cadherin、ZO-1表达的增加,vimentin及snail表达的减少;而在LCN2过表达的细胞系中恢复snail的表达后,同样可减弱LCN2对E-cadherin、ZO-1、vimentin和snail及迁移能力的影响。我们对结直肠癌病人临床组织样本,运用免疫组织化学方法,检测了LCN2、E-cadherin、β-catenin、增殖标志物Ki67,以及NF-κB的表达,并分析LCN2与E-cadherin、β-catenin以及Ki67三个EMT重要标志物的关系及LCN2及NF-κB的表达对结直肠癌预后的临床意义。结果证实,LCN2在结直肠癌原发灶中的表达明显高于淋巴结转移灶中的表达;且LCN2与E-cadherin呈明显正相关,与核内β-catenin的分布,及Ki67呈明显负相关;裸鼠体内成瘤的组织切片染色中也发现,LCN2与E-cadherin的变化水平相一致,与vimentin及Ki67的变化水平相反。而且根据LCN2及NF-κB的表达进行分组发现,LCN2表达阳性且NF-κB表达阴性的病人,其组织切片中snail在核内的分布明显较低,预后及五年生存率明显较好。最后,我们对ATRA在LCN2调控的结直肠癌EMT中的作用进行了探索。在内源性表达LCN2的SW480细胞系中,加入较高生理浓度的ATRA,检测其对EMT标志物、LCN2及迁移的影响。我们发现,ATRA可明显上调结直肠癌细胞中E-cadherin的表达及LCN2的水平,抑制vimentin的表达,NF-κB/snail信号通路的活性及细胞的迁移能力。LCN2特异性抗体可明显逆转ATRA引起的上皮表型变化及迁移能力的下调。综合上述研究结果,我们得出以下结论:1.在结直肠癌细胞系及裸鼠体内,LCN2可上调上皮标志物表达,下调间质标志物的表达,同时抑制细胞增殖,迁移和侵袭及肿瘤形成及转移能力;从而抑制结直肠癌中EMT及转移的发生。2.在结直肠癌细胞中,LCN2可通过抑制NF-κB/snail信号通路抑制结直肠癌中EMT的发生;LCN2表达阳性且NF-κB表达阴性的结直肠癌患者,其预后及五年生存率较好;因此LCN2/NF-κB/snail信号通路可能成为结直肠癌治疗的新靶点。3.在结直肠癌细胞中,ATRA可依赖LCN2,发挥抑制EMT的发生及NF-KB/snail信号通路的活性及结直肠癌细胞的迁移的作用。因此,ATRA可能可应用于临床结直肠癌的治疗。
文内图片：
图片说明：图３－１邋ｐＬＶＸ－ｓｈＲＮＡ２干扰载体及ｐＬＶＸＪＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ邋１表达载体图谱逡逑１７逡逑
文内图片：
图片说明： ＬＣＮ２的表达情况进行检测。结果表明，只有ＳＷ６２０和民ＫＯ两株细胞系中ＬＣＮ２表逡逑达较低，我们随后选取这两株细胞系进行后续的ＬＣＮ２过表达实验，选取ＳＷ４８０和逡逑ＨＴ２９细胞系进行ＬＣＮ２敲除的实验（图４－１）。逡逑ＧＡＰ邋Ｄ邋Ｈ逡逑ＬＣＮ２邋一 邋？一邋￣？邋逦逦—一逡逑ＧＡＰＤＨ邋逦—逦逦逡逑困４－１邋ＬＣＮ２在结直肠癌细胞系中ｍＲＮＡ及蛋白水平的表达逡逑４．１．２邋ＬＣＮ２在结直肠癌组织中的表达逡逑４．１．２．１逦ＬＣＮ２在结直肠癌组织和正常组织中的表达逡逑我们在７对配对的结直肠癌组织和癌旁组织中对ＬＣＮ２的表达进行的检测结果也显逡逑示，ＬＣＮ２在癌症组织中的表达（４／７）明显高于癌旁组织（１／７）（图４－２Ａ）。利逡逑用ＴＣＧＡ数据库信息，我们在１５例配对的肿瘤组织与正常组织（男３例，女１２例）逡逑中，对ＬＣＮ２的ＲＮＡ表达水平进行的分析也证实，ＬＣＮ２在结直肠癌纽织中的表达逡逑（均值８４．８５）明症高于正常组织（均值４８．３５邋）邋（Ｐ＝０．０３６）（图４－２Ｂ）。随后在结逡逑直肠癌原发灶组织和淋己结转移灶组织中，进行免疫纽织化学检测ＬＣＮ２的表达，，逡逑４２逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 王汉涛 ,Kraemer M.;随访危险因素分析:复发和非复发结直肠癌的比较[J];中国实用外科杂志;2001年12期
2 苏森;患结直肠癌妇女后代癌症的危险性增加[J];中国肿瘤;2001年06期
3 汪一虹;在确定的法国人群中年龄<45岁结直肠癌病人与≥45岁结直肠癌病人的比较[J];国外医学(消化系疾病分册);2002年01期
4 李会晨;结直肠癌解剖位置的连续性右向迁移[J];国外医学.外科学分册;2003年03期
5 李志霞;结直肠癌复发及转移的综合治疗[J];中华胃肠外科杂志;2003年06期
6 何建苗,蒲永东,曹志宇,刘卫平;老年人结直肠癌186例的外科治疗[J];中华胃肠外科杂志;2003年05期
7 保红平,方登华,高瑞岗,李奎,张雪松,刘天锡;青年人结直肠癌临床病理分析[J];中国普外基础与临床杂志;2004年01期
8 章江;;监测结直肠癌非常必要[J];国外医学情报;2004年04期
9 郜文秀,杨艳芳,梁小波,李耀平,李佩珍;细胞粘附分子变异体在结直肠癌中的表达及预后[J];中国公共卫生;2005年07期
10 Nozawa T. ,Enomoto T. ,Koshida Y. ,M. Kuranami,王志宇;人结直肠癌黏膜下血小板源性内皮细胞生长因子特异性增强表达[J];世界核心医学期刊文摘(胃肠病学分册);2005年06期
相关会议论文 前10条
1 郑树;;结直肠癌预后与转移相关因素分析[A];2005年浙江省肿瘤学术会议全国大肠癌转移与复发的诊治研讨会学术论文集[C];2005年
2 邹一峰;吴小剑;兰平;;结直肠癌免疫治疗新进展[A];第十一次全国中西医结合大肠肛门病学术会议论文汇编[C];2006年
3 郁宝铭;;结直肠癌治疗的进展及其新理念[A];2006年浙江省肛肠外科学术年会论文汇编[C];2006年
4 王锡山;;结直肠癌治疗的困惑之我见[A];第九届全国肿瘤转移学术大会暨2011年黑龙江省医学会肿瘤学年会报告集[C];2011年
5 秦建平;;未病思想中的结直肠癌预防[A];贵州省中西医结合学会肛肠学会第五届学术交流会暨新技术新进展学习班论文汇编[C];2012年
6 高文庆;陈会林;童蕾;陆松春;;老年梗阻性结直肠癌诊疗体会(附42例报告)[A];首届“之江中医药论坛”暨浙江省中医药学会2011年学术年会论文集[C];2011年
7 王启远;周长江;高云飞;徐岩;李坤;;血管内皮生长因子与结直肠癌[A];《中华急诊医学杂志》第八届组稿会暨急诊医学首届青年论坛论文汇编[C];2009年
8 巴一;;结直肠癌靶向治疗进展[A];第三届中国肿瘤内科大会教育集暨论文集[C];2009年
9 何超;朱洪波;;结直肠癌的生物治疗[A];2009年浙江省肿瘤外科学术年会暨肿瘤外科规范化诊治学习班论文汇编[C];2009年
10 万德森;;进一步提高结直肠癌疗效的思考[A];2009年浙江省肿瘤学术年会暨肿瘤诊治新进展学习班论文汇编[C];2009年
相关重要报纸文章 前10条
1 中华医学会肿瘤学分会主任委员 顾晋;分期不精确 致结直肠癌过度治疗[N];健康报;2012年
2 本报记者 贾岩;跨线治疗成结直肠癌最后防线[N];医药经济报;2012年
3 本报记者 贾岩;跨线治疗构筑结直肠癌最后防线[N];医药经济报;2012年
4 本报记者 林琳;结直肠癌：可以治愈的癌症[N];医药经济报;2013年
5 记者 张妍 通讯员 熊静帆 朱品磊;深圳结直肠癌发病高于全国[N];深圳商报;2013年
6 本报记者 孙刚;预防结直肠癌：请管住嘴[N];解放日报;2013年
7 上海市中医医院肿瘤科 侯凤刚 副主任医师;中医药在结直肠癌治疗中的作用和特色[N];上海中医药报;2014年
8 李华虹 孙瑜淼 记者 李丽云 实习生 阴浩;专家呼吁：结直肠癌应多学科规范化诊疗[N];科技日报;2014年
9 ;降低结直肠癌复发有新疗法[N];人民日报;2003年
10 韩自力;新化疗方案可高效治疗结直肠癌[N];健康报;2007年
相关博士学位论文 前10条
1 陈涛;MicroRNA-31/FIH-1调控关系在结直肠癌发生发展中的作用及其机制研究[D];复旦大学;2014年
2 任翡;MYBL2基因在结直肠癌的表达及机制的初步探讨[D];复旦大学;2014年
3 吴朋;结直肠癌中microRNA-615基因甲基化及其生物学特性探究[D];复旦大学;2014年
4 李泽武;MicroRNA-203靶向ZNF217基因调控结直肠癌生物学行为的研究[D];山东大学;2015年
5 徐兴远;低分子肝素对结直肠癌患者预后的影响及相关机制的研究[D];复旦大学;2014年
6 梁洪亮;miR-454在结直肠癌中的功能及其作用机制[D];山东大学;2015年
7 金鹏;MMR蛋白在雌激素致结肠癌细胞凋亡中的作用及SEPT9检测结直肠癌的研究[D];第三军医大学;2015年
8 珠珠;云南省Lynch综合征候选基因标志物研究[D];昆明医科大学;2014年
9 周智航;SEMA3F通过下调ASCL2-CXCR4轴而抑制结直肠癌转移的分子机制[D];第三军医大学;2015年
10 王林;MiRNA-300对结直肠癌肿瘤侵袭和增殖的影响及其调控机制的初步研究[D];第三军医大学;2015年
相关硕士学位论文 前10条
1 颜斐斐;术后结直肠癌患者癌因性疲乏与影响因素的研究[D];南方医科大学;2009年
2 李斌;结直肠癌患者就诊延迟分析[D];中南大学;2009年
3 叶建杰;慈溪市结直肠癌危险因素病例对照研究[D];浙江大学;2008年
4 赵波;结直肠癌危险因素及临床流行病学特征的调查与分析[D];广西医科大学;2013年
5 宋艳敏;PAQR3基因甲基化水平与结直肠癌关系的研究[D];河北大学;2015年
6 黎江;Oct4B1在结直肠癌干细胞中的表达及其与Twist的相关性研究[D];遵义医学院;2015年
7 杨文婷;PD-L1、SIRT1在结直肠癌组织中的表达及意义[D];福建医科大学;2015年
8 罗佳;二代测序分析散发性结直肠癌和息肉的基因突变[D];福建医科大学;2015年
9 崔慧鹏;精氨酸琥珀酸合成酶（ASS1）高表达与结直肠癌恶性进展的相关性研究[D];中国人民解放军医学院;2015年
10 崔娟娟;p53和nm23在结直肠癌中的表达及其临床意义[D];河北联合大学;2014年
本文编号：
2514878
