【摘要】：背景:乳腺癌的多药耐药性(Multidrug Resistance,MDR)是导致化疗失败及复发的最主要原因。肿瘤细胞可随诱导药物、诱导方式、细胞分化阶段及所处微环境的不同而表现出不同的耐药表型。MDR是指肿瘤对一种化疗药物出现耐药的同时对其他结构和功能各异的药物亦产生交叉耐药现象。难以避免的化疗耐药一直是有效控制乳腺癌的关键瓶颈。因此深入的研究乳腺癌的耐药机制,寻找新的耐药相关生物学标志物对于有效逆转化疗耐药,提高乳腺癌的整体治疗水平具有非常重要的理论意义,并且为其临床应用开展提供前期基础。micro RNA(mi RNA)是由长18~24个核苷酸组成的、内源性高度保守的非编码单链RNA,mi RNA发挥作用的机制是通过与靶基因的m RNA结合进而降解或者抑制其翻译,不同的mi RNA可以靶向调控同一靶基因,而一个mi RNA在不同情况下可以调控下游不同的靶基因,其基因表达调控方式为我们更加全面地了解肿瘤的发生发展,包括肿瘤细胞的MDR均开拓了更多的思路,对进一步认识和理解肿瘤耐药发生的潜在的分子机制均具有重要意义。在本文的工作中,我们主要对乳腺癌多药耐药相关mi RNA:mi R-205在乳腺癌耐药过程中发挥的功能,明确与mi R-205直接结合并受其调控的靶基因,及是否通过该靶基因影响乳腺癌的耐药及相关分子机制进行了研究与探讨。方法:1.使用mi RNA芯片对敏感株乳腺癌细胞MCF-7与耐药株乳腺癌细胞MCF-7/A02中的人源mi RNA表达谱进行检测,筛选出在两种细胞系中表达差异最显著的mi RNA:mi R-205作为后续实验研究的对象。2.用Taqman实时定量PCR的方法在不同乳腺癌细胞及对应耐药细胞株中验证mi R-205表达与肿瘤细胞耐药的相关性,并在其他耐药细胞系进一步验证。并且检测新辅助化疗前乳腺癌组织中mi R-205表达的情况,了解mi R-205的表达与乳腺癌新辅助化疗敏感性的关系。3.在MCF-7/A02细胞和CALDOX细胞中用慢病毒感染方式过表达mi R-205,以MTT方法检测细胞对阿霉素(DOX)、紫杉醇(Taxol)、依托泊苷(VP-16)的IC50,检测其耐药性的变化;采用平板克隆形成实验方法,评价肿瘤细胞对阿霉素、紫杉醇的敏感性;通过Annexin V/PI染色法,Caspase-3/7活性检测以及Caspase-9检测法等方法检测紫杉醇对目标细胞的凋亡诱导作用,同时使用实时定量PCR法检测凋亡相关基因的m RNA水平改变,采用Western-blotting检测了PI3K/AKT信号转导通路活性及相关凋亡蛋白的改变。4.综合生物信息学预测软件得到mi R-205的候选基因VEGFA和FGF2。实时定量PCR方法检测FGF2与VEGFA在MCF-7 VS MCF-7/A02细胞和CAL51VS CALDOX细胞系中的表达差异,同时ELISA法检测四组细胞上清液中VEGFA和FGF2两种因子的变化情况。进一步检测MCF-7/A02和CALDOX两组耐药细胞系转染mi R-205后,细胞VEGFA和FGF2基因的变化及上清液中两种因子的变达改变,分析比较各细胞系中mi R-205表达、VEGFA和FGF2基础表达水平的相关性。双荧光素酶报告实验验证mi R-205和VEGFA 3'UTR和FGF23'UTR的靶向关系。5.检测新辅助化疗前乳腺癌组织中VEGFA和FGF2表达情况,分析其表达水平与乳腺癌新辅助化疗敏感性及mi R-205的相关性。以MTT方法检测过表达VEGFA和FGF2和沉默两者后细胞对阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的IC50,检测其药物敏感性的变化;并进一步检测VEGFA和FGF2对细胞凋亡的影响。6.采用rescue实验检测VEGFA和FGF2的过表达是否可以逆转mi R-205对乳腺癌化疗耐药性抑制,以确认VEGFA和FGF2作为mi R-205下游功能性的直接靶点调控乳腺癌化疗耐药性:以MTT方法检测处理后各组细胞对阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的IC50,检测其耐药性的变化;采用平板克隆形成实验方法,评价各组细胞对阿霉素、紫杉醇的敏感性;通过Annexin V/PI染色法,Caspase-3/7活性检测以及Caspase-9检测法等方法检测紫杉醇对各组细胞的凋亡诱导作用,同时检测凋亡相关蛋白及PI3K/AKT信号通路蛋白的变化,以确认mi R-205与VEGFA和FGF2的相互作用对下游通路的影响。7.采用上述方法检测在MCF-7/A02和CALDOX耐药细胞系应用PI3K抑制剂后对凋亡的影响,以进一步证明mi R-205对MCF-7/A02与CALDOX细胞化疗敏感性的调控作用是通过影响PI3K/AKT通路活性完成的。8.建立裸鼠皮下移植瘤模型。将BALB/c裸鼠随机分为四组,将MCF-7/A02-mi R-205、MCF-7/A02-NC、CALDOX-mi R-205和CALDOX-NC细胞的细胞悬液分别接种于各组裸鼠右腋皮下,约1周后,开始每隔3天清晨用游标卡尺测量小鼠移植瘤最长径L和最短径W,计算肿瘤体积并做好记录。于d15最后一次测量肿瘤体积后,给药DOX(1mg/kg)Taxol(2.5mg/kg)每三天1次腹腔注射。开始每隔3天测量小鼠移植瘤,计算肿瘤体积,于d45最后一次测量肿瘤体积,统一颈椎脱臼处死,剥离瘤块,称重,液氮保存备用。分别取各组瘤组织,实时定量PCR检测MCF-7/A02-mi R-205及空白对照细胞移植瘤体中mi R-205的表达及VEGFA、FGF2、bax和survivin的表达变化情况。ELISA法检测动物模型血液中VEGFA和FGF2的表达变化。结果:1.对比MCF-7细胞与MCF-7/A02细胞中mi RNA芯片表达谱结果,在这两种细胞内共获得19个差异表达的mi RNA,结合本课题组前期血清学mi RNA检测结果,选定在耐药细胞系中为下调表达的mi R-205为进一步的研究对象。2.采用q PCR方法对芯片结果进行验证后发现在乳腺癌MCF-7细胞、Cal51细胞、MTMEC细胞及其对应耐药细胞系中,mi R-205在耐药细胞中低表达,同时在白血病K562细胞、HL60细胞、淋巴瘤BJAB细胞及对应耐药细胞中mi R-205表达量与耐药性呈负相关性。mi R-205表达量与乳腺癌患者新辅助化疗疗效正相关,即mi R-205表达越高疗效越好。3.在乳腺癌耐药细胞MCF-7/A02和CALDOX细胞中过表达mi R-205后肿瘤细胞对阿霉素的敏感性提高,同时对紫杉醇、依托泊苷的化疗敏感性均有所提高;平板克隆形成实验检测发现,相同化疗药物浓度下,mi R-205过表达能抑制MCF-7/A02和CALDOX细胞的克隆形成能力;对于由紫杉醇诱导的细胞凋亡检测实验,过表达mi R-205后乳腺癌细胞凋亡程度显著提高;过表达mi R-205后,各组细胞凋亡基因Bax m RNA表达增加,抗凋亡基因survivin m RNA表达下降;在蛋白水平的检测中,p AKT表达下降,促凋亡蛋白Bax表达增加,抗凋亡蛋白survivin表达下降。4.生物信息学软件预测显示VEGFA和FGF2 m RNA 3'UTR和mi R-205有两处可以结合的保守序列。VEGFA和FGF2在两种耐药细胞系中表达均高于在对照细胞中的表达,在细胞上清液中的两种因子的表达也明显升高。且在mi R-205过表达的乳腺癌细胞系中,mi R-205不仅可以在m RNA水平并且也可以在细胞因子水平抑制VEGFA和FGF2的表达。双荧光素酶报告实验中,mi R-205可以降低构建的VEGFA 3'UTR和FGF2 3'UTR野生载体的荧光活性。5.分析新辅助化疗前患者乳腺癌组织中mi R-205和VEGFA和FGF2表达,发现三者呈负相关,并且mi R-205含量越高,患者新辅助化疗疗效越好,而高表达VEGFA和FGF2的患者其新辅助化疗疗效较差。在MCF-7和CAL 51细胞中加入VEGFA和FGF2因子后,直接导致细胞对阿霉素的耐药,凋亡减少,Bax的m RNA和蛋白表达均下降,而survivin m RNA和蛋白表达增多,激活PI3K/AKT通路;而外源转入VEGFAsi RNA和FGF2 si RNA的CALDOX细胞,对阿霉素的敏感性提高。6.Rescue实验结果显示,在mi R-205稳定转染细胞中转入VEGFA和FGF2后,降低耐药细胞的化疗敏感性,凋亡减少。VEGFA和FGF2过表达后,逆转mi R-205促进紫杉醇诱导的细胞凋亡,并且可减弱mi R-205对PI3K/AKT通路的削弱作用。Bax的m RNA和蛋白表达均下降,而survivin m RNA和蛋白表达增多。7.MCF-7/A02细胞给予10μM,CALDOX细胞给予2μM PI3K抑制剂LY294002处理24小时,同时添加不同浓度的紫杉醇(0.25μM VS 2.5 n M)处理48小时后,Bax的m RNA和蛋白表达均增加,而survivin m RNA和蛋白表达减少。也间接提示mi R-205是通过抑制PI3K/AKT通路活性来诱导凋亡而增加乳腺癌细胞化疗敏感性的。8.通过裸鼠皮下移植瘤模型证明过表达mi R-205能显著抑制MCF-7/A02接种后小鼠肿瘤体积的生长,同时能够提高裸鼠接受紫杉联合蒽环类化疗的敏感性。肿瘤组织中VEGFA、FGF2和survivin表达减少,bax表达增多。小鼠外周血清中VEGFA和FGF2两种因子表达下降。而CALDOX-mi R-205细胞接种后的小鼠未见明显成瘤。结论:mi R-205在乳腺癌细胞及其他多种肿瘤细胞中与多药耐药性呈负相关。mi R-205表达量与乳腺癌患者新辅助化疗疗效正相关,其表达越高疗效越好。在乳腺癌细胞中过表达mi R-205后,肿瘤细胞对阿霉素的敏感性提高,同时对紫杉醇、依托泊苷的化疗敏感性均有所提高;并能促进紫杉醇诱导的细胞凋亡。并且mi R-205是直接通过靶向VEGFA和FGF2实现削弱PI3K/AKT通路活性,减少p AKT表达,增加促凋亡蛋白Bax,减少抗凋亡蛋白survivin表达进而实现其促进凋亡影响乳腺癌细胞多药耐药的功能。过表达mi R-205能明显抑制裸鼠移植瘤的生长,并且可以通过抑制VEGFA和FGF2提高肿瘤的化疗敏感性。以mi R-205为治疗靶点逆转乳腺癌的耐药,将为乳腺癌的治疗带来新的探索。
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图片说明： .1：MCF-7（S1、S3、S4）与 MCF-7/A02（R1、R2、R3）细胞中差异表达的 micr表达谱对耐药细胞系及对应亲本细胞系差异表达的 19 个 microRNAs 中，前期研究中发现 miR-205 在癌组织中是下调的，并且可以促进 MCF亡[21]，所以我们选择 miR-205 作为后续研究的主要对象。Taqman 实时定量 PCR 法验证 microRNA 芯片结果到了 microRNA 芯片结果后，我们在乳腺癌 MCF-7 细胞与 Cal51 细-205 的表达量用 Taqman 实时定量 PCR 的方法进行了验证。结果5 的表达量随细胞耐药程度的增加而减低，差异有统计学意义（P<02-A,B）。除了 MCF-7 细胞、Cal51 乳腺癌细胞当中，miR-205 表达量性的关系在人乳腺癌 MTMEC 细胞、白血病 K562 细胞、HL60 细胞JAB 细胞中也得到了验证（图 1.2-C），即这些耐药细胞系中 miR-2均不同程度地低于其相对的敏感细胞系，，差异有统计学意义（P<0.
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图片说明： 图 1.3：miR-205 表达量与乳腺癌患者新辅助化疗疗效相关性分析1.2.4 miR-205 慢病毒侵染与稳转细胞株的建立表达 miR-205 的慢病毒和对照慢病毒均从苏州吉玛基因公司购买，分别命名为“LV2（U6/Puro）-hsa-miR-205-5p”和“LV1-NC”（图 1.4.1 和 1.4.2 测序结果）。LV1-NC 序列（5’ to 3’）：TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC图 1.4.1 LV1-NC 测序结果LV2（U6/Puro）-hsa-miR-205-5p（5’ to 3’）：TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG图 1.4.2 LV2（U6/Puro）-hsa-miR-205-5p 测序结果在得到了 LV2（U6/Puro）-hsa-miR-205-5p 慢病毒真核表达载体后，我们用慢病毒感染的方法使 MCF-7/A02 和 CALDOX 细胞过表达 miR-205，感染 96h
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
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本文编号：2515731
