MY06在肝癌细胞增殖及侵袭转移中的作用及机制研究

发布时间：2019-07-25 08:28

【摘要】：目的:肝癌的恶性程度高,预后差,目前尚无令人满意的的治疗手段。肝癌病因未明,但可以肯定的是其发生、发展是一个多基因、多步骤的复杂过程。随着生物技术的发展,如RNA干扰技术,基因编辑技术等,使从基因水平治疗肝癌成为可能。因此,找到在肝癌的增殖、侵袭转移过程中发挥重要作用的靶基因,通过针对性地修复、置换致病基因或纠正异常基因的表达调控,可以达到对肝癌的治疗作用。肌球蛋白VI(MY06)是其家族中唯一一个向微丝负极移动的蛋白,能水解ATP酶产生能量推动肌动蛋白丝的运动,是细胞的马达蛋白,能为细胞的迁移提供动力,参与吞饮或吞噬泡的运输,负责将高尔基体的分泌泡运输到胞内适当的位置,故有动力马达之美称。有报道称MY06在卵巢癌、前列腺癌及肾癌等恶性肿瘤中高表达,而且抑制MY06的表达能有效减少肿瘤的扩散和转移。我们的预实验已经证明MY06在肝癌组织中高表达,提示MY06在肝癌的发生、发展中可能扮演着重要角色。本次实验,我们希望通过增加样本量,进一步观察MY06在肝癌组织中的蛋白表达情况,明确MY06在肝癌增殖及侵袭转移中的作用,并初步探讨其可能的内在机制,为肝癌的靶向基因治疗提供理论依据。方法:我们的研究内容分为三个部分。1、通过免疫组化的方法,对比肝癌组织及正常肝组织中MY06的表达情况,明确MY06与肝癌发生发展的相关性。2、进一步明确干扰MYO6表达在肝癌细胞增殖中的作用并探讨其机制。2.1我们采用慢病毒(LV-MYO6 shRNA-GFP)感染筛选出的HepG2及SMMC7721肝癌细胞,通过荧光显微镜检测GFP绿色荧光,观察两种肝癌细胞的慢病毒感染效率,为进一步确定MYO6的干扰情况,我们通过real-time PCR及Western blot分别检测慢病毒感染HepG2及SMMC7721后MYO6 mRNA及蛋白表达水平。2.2我们通过MTT实验、克隆形成实验和Brdu掺入实验确定干扰MY06后肝癌细胞的增殖情况。2.3分别观察了干扰MY06表达后肝癌细胞的凋亡、自噬及细胞周期的改变。具体为:通过流式细胞技术检测干扰myo6表达后hepg2肝癌细胞凋亡水平的变化;通过westernblot及细胞免疫荧光检测干扰my06表达对细胞自噬的影响;通过流式细胞术分析干扰my06表达后hepg2细胞的细胞周期分布。2.4我们采用细胞内信号通路检测试剂盒结合westernblot技术检测所涉及凋亡、自噬和细胞周期改变信号通路的关键蛋白,初步探讨其发生机制及信号通路。3、我们采用transwell小室检测细胞侵袭转移能力并通过westernblot技术检测侵袭转移相关蛋白的表达变化,从而研究了干扰my06表达对肝癌细胞侵袭转移能力的影响及其机制。结果:1、通过免疫组化得出结果:与正常肝组织相比,肝癌组织中myo6的表达显著高于正常肝组织。2、干扰my06的表达,抑制了肝癌的增殖能力。其机制可能涉及激活p38-mapk通路和降低pras40磷酸化水平共同作用抑制肝癌增殖,其中通过激活p38-mapk通路促进肝癌细胞凋亡和降低pras40磷酸化水平抑制细胞自噬可能起重要作用。2.1慢病毒(lv-myo6shrna-gfp)感染hepg2及smmc7721肝癌细胞(moi=10)的感染率均超过了80%,感染后my06mrna和蛋白的表达都有明显下降。2.2mtt实验、克隆形成实验及brdu掺入实验结果示:干扰myo6表达后明显降低hepg2及smmc7721肝癌细胞增殖并抑制肝癌细胞dna合成。2.3流式细胞技术检测干扰myo6表达后hepg2肝癌细胞凋亡水平的变化,实验结果显示:凋亡明显增加;采用westernbolt技术检测自噬相关蛋白,结果显示:干扰myo6表达显著上调自噬底物p62的表达水平,同时干扰myo6后lc3i向lc3ii转化明显减少,细胞免疫荧光得到类似结果,进一步验证了干扰myo6表达抑制肝癌细胞自噬水平;为了探讨干扰myo6对肝癌细胞细胞周期的影响,我们在hepg2肝癌细胞转染myo6shrna四天后,通过流式细胞术分析hepg2细胞的细胞周期分布。结果显示:干扰myo6表达后g0/g1期和g2/m期的细胞的百分数相应增加,而s期细胞比例降低。2.4为了分析干扰my06的表达抑制肝癌细胞增殖能力的机制,我们采用了细胞内信号通路检测试剂盒结合westernblot的检测方法,发现在相关的信号通路中p38-mapk通路被激活,而pras40的磷酸化水平被抑制。据此,我们推测其机制可能涉及激活p38-mapk通路和降低pras40磷酸化水平共同作用抑制肝癌增殖,其中通过激活p38-MAPK通路促进肝癌细胞凋亡和降低PRAS40磷酸化水平抑制细胞自噬可能起重要作用。3、干扰MY06抑制肝癌细胞的侵袭转移能力,可能与抑制上皮间质转化有关。3.1我们采用Transwell侵袭实验进行研究,结果显示:干扰MYO6表达后细胞透膜数明显减少,提示肝癌的侵袭转移能力下降3.2为了进一步探讨其机制,我们采用Western blot技术检测侵袭转移相关蛋白的表达变化。结果显示:干扰MYO6表达后肝癌细胞E-cadherin表达明显上调,而Vimentin表达下调。说明干扰MYO6表达可能通过抑制上皮间质转化来抑制肝癌细胞侵袭转移能力。结论:MYO6在肝癌组织中高表达,干扰MYO6表达抑制了肝癌细胞增殖。其机制可以从肝癌细胞的凋亡、自噬和细胞周期变化三个方面考虑。其信号通路可能涉及通过激活p38-MAPK通路和下调PRAS40磷酸化水平抑制细胞增殖。其中,通过激活p38-MAPK通路促进肝癌细胞凋亡和降低PRAS40磷酸化水平抑制细胞自噬可能起重要作用。此外,我们研究发现干扰MYO6表达通过抑制肝癌细胞上皮间质转化来抑制肝癌细胞侵袭转移能力。本研究结果通过体外实验阐述了MYO6在肝癌增殖以及侵袭转移中的作用及相关机制,需要进一步通过体内实验研究去证实MYO6的作用,以期为肝癌的基因靶向治疗提供理论依据。
【图文】：

图 1 细胞内信号通路检测试剂盒抗体列阵4.2 蛋白电泳（Western blot）法①蛋白提取及样品制备各种处理的细胞待孵育结束后细胞刮刀刮下细胞，2000 rpm离心5 min收集细胞。预冷的 PBS 重悬洗涤细胞后 2000 rpm 离心 5 min，重复两次后弃 PBS，根据沉淀细胞的量加入相应体积的细胞裂解液，吹打混匀，冰浴 15 min 后用超声波细胞破碎仪在冰浴中短暂多次超声细胞，直至裂解液不粘稠。4 ℃ 12000 rpm离心 10 min，吸取上清。采用 BCA 蛋白定量试剂盒测定以上所提取蛋白的浓度，调整上样量使各组蛋白终浓度一致，在样品中按 4：1 加入 5 x 上样缓冲液，100℃煮沸 5 min 使蛋白质变性，样品经变性后可直接跑电泳或储存于-80℃冰箱待用。② SDS-PAGE 凝胶电泳1) 将玻璃板洗净后无水乙醇冲洗晾干，按长板对短板安装于架子上；

MY06在肝癌细胞增殖及侵袭转移中的作用及机制研究

图 2 A 为 Transwell 迁移模型；B 为 Transwell 侵袭模型① Transwell 迁移实验（如图 2 A）：（1） HepG2 细胞培养及慢病毒感染步骤同前。转染前 HepG2 细胞分组情况如下：Control 组，Lv-shCon 组，Lv-shMYO6 组。（2）从培养箱中取出 6 孔板，放入超净工作台，吸弃上清液，用 PBS 液清洗 2-3次，每孔加入 0.5ml 的 0.25%胰蛋白酶，静置 1-2 min，在倒置显微镜下观察细胞形态逐渐变圆时，弃胰蛋白酶，分别加入 1ml 含 10%胎牛血清的完全培养基终止消化，，然后用移液枪反复地轻轻吹打，使贴壁细胞成单细胞悬液，移入1.5mlEp 管中，1500rpm×5min 离心，弃去培养液，加 1mL PBS 重悬，1500rpm×5min 离心后，去上清液，再用含 0.2%BSA 的无血清培养基重悬细胞。（3）细胞计数：用移液管将细胞重悬液轻轻吹打均匀，吸取细胞悬液滴入细胞计数
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

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