Cripto-1对巨噬细胞分泌和吞噬功能以及癌基因Skp2表达的调控作用和机制研究

发布时间：2019-07-29 20:16

【摘要】：Cripto-1是EGF-CFC家族的成员,在肿瘤的发生及转移过程中发挥重要作用。但目前为止,有关Cripto-1对免疫功能的影响尚不清楚。本文拟从巨噬细胞角度探讨原癌基因Cripto-1对免疫功能的影响及其机制。为了探讨Cripto-1对巨噬细胞功能的影响,我们建立了一个稳定表达Cripto-1的L02细胞系,并用稳转细胞的上清液对巨噬细胞进行处理,之后通过实时定量PCR和Western blot方法检测巨噬细胞产生细胞因子的情况。结果显示,实验组的巨噬细胞中炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6以及抗炎症因子IL-10的表达显著上调,而抗炎症因子TGF-β的表达并没有发生明显的变化。因为稳转细胞上清中除了含有Cripto-1蛋白外,还含有其它分泌蛋白,为了确定细胞上清对巨噬细胞分泌功能的影响是否是由Cripto-1引起的,我们用原核表达纯化的Cripto-1蛋白处理巨噬细胞,结果发现,Ctipto-1蛋白对巨噬细胞功能的影响与细胞上清具有相同的趋势。这些结果表明,Cripto-1可能通过上调巨噬细胞中某些炎症因子和抗炎症因子的表达,进而对机体的免疫功能产生影响。之后我们研究了Cripto-1对巨噬细胞吞噬功能的影响。我们选取小鼠原代巨噬细胞以及人的巨噬细胞进行实验,利用稳转Cripto-1的细胞上清液或者纯化的Cripto-1蛋白处理巨噬细胞,之后通过鸡红细胞吞噬实验检测巨噬细胞的吞噬功能。结果显示,实验组的巨噬细胞吞噬能力较对照组有明显提高。以上结果表明,Cripto-1对巨噬细胞的分泌功能和吞噬功能均具有一定的调节作用。我们进一步分析了Cripto-1调节巨噬细胞免疫功能的细胞内信号转导机制。我们利用纯化的Cripto-1蛋白处理巨噬细胞,20分钟后检测NF-κB信号的活化情况。结果显示,Cripto-1处理后,巨噬细胞中的p-IKK水平显著提高,并且p65的入核也显著增加。也就是说,Cripto-1激活了巨噬细胞中的NF-κB信号通路。为了阐明Cripto-1是否是通过NF-κB信号通路来调控巨噬细胞功能的,我们又利用NF-κB信号通路的抑制剂PDTC去抑制细胞内的NF-κB信号,之后检测巨噬细胞的功能。结果显示,Cripto-1诱导的巨噬细胞分泌功能和吞噬功能被明显抑制。以上结果提示,Cripto-1可通过激活NF-κB信号途径增强巨噬细胞的吞噬功能,并促进部分炎症因子及抗炎症因子的表达。Skp2(S-phase kinase associated protein 2)属于F-box蛋白家族成员,在多种肿瘤细胞中高表达,对肿瘤的发生发展具有重要的作用。本实验室前期的研究发现,293T细胞中转染Cripto-1的真核表达载体后,细胞中Skp2的mRNA和蛋白的表达明显被抑制。而且我们通过报告基因法和免疫印迹法证明在293T细胞中,Cripto-1的过表达明显抑制了p38/MAPK信号通路。暗示Cripto-1调控Skp2的表达是通过p38/MAPK信号通路来实现的。那么为了证明这一结果,我们将p38的失活突变体DN-p38转入293T细胞内以抑制p38/MAPK信号。结果显示,当p38/MAPK信号被抑制以后,Skp2的表达量明显下降。这些实验结果说明,Cripto-1可通过p38/MAPK信号通路调控Skp2的表达。为了进一步验证以上结论,我们利用靶向Cripto-1的siRNA对Huh7细胞进行处理。结果显示,当Cripto-1表达下调时,p38被激活,Skp2的表达上升。但是当共转染p38的失活突变体DN-p38后,这一实验结果被逆转,即下调了p-p38的表达,Skp2的表达量也随之降低。以上研究结果提示,Cripto-1通过抑制p38/MAPK信号通路调控Skp2的表达。本研究证实了原癌基因Cripto-1参与了机体免疫系统中巨噬细胞功能的调控,这为我们研究癌基因与机体免疫功能之间的关系奠定了一定的实验基础。并且Cripto-1还可通过p38/MAPK信号通路调控原癌基因Skp2的表达。这一研究结果为人们开发以Skp2为靶点的抗癌药物提供了重要的理论依据。
【图文】：

二）原癌基因 Skp2 的结构癌基因 Skp2 定位于常染色体 5p13，其基因全长大约为 31962b2 编码的产物由 436 个氨基酸组成[115]。kp2 包括一个 F-box 结构域、十个富含亮氨酸的重复区域和 Lin中 Fox 结构域的作用是可以与 Skp1 相结合，富含亮氨酸的重复物识别的区域[115]。三）原癌基因 Skp2 的生物学功能kp2 可以与 Skp1 和 Cull 共同组成 SCF 复合物，SCF 复合物又称合物，，其作为一个 E3 连接酶，在泛素-蛋白酶体降解途径中发挥

Cripto-1 是表皮生长因子 EGF-CFC 家族成员，已经证过程中发挥重要作用。本研究主要从巨噬细胞角度探功能的影响，以及 Cripto-1 发挥免疫调节功能的机制原癌基因 Cripto-1 对巨噬细胞功能的影响，我们首先构L02 细胞系。我们将 Cripto-1 的真核表达载体（pCI-n胞，经过 G418（浓度为 400 600 μg/mL）的反复筛选上清，并提取细胞质蛋白，利用 Western blot 方法检测 Cripto-1 蛋白。如图2所示，稳转细胞的胞质蛋白中检测到了Cripto-1则无表达。并且我们也在收集的细胞上清液中检测到了显示，我们构建的这个稳定表达 Cripto-1 的 L02 细胞系的实验研究。之后，我们将利用这一细胞系，研究 Cri控作用。
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2

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本文编号：2520732