miR-129和miR-873在神经胶质瘤中的作用及机制研究

发布时间：2019-07-30 14:42

【摘要】：背景：神经胶质瘤(以下简称胶质瘤)是起源于神经外胚层的最常见的颅内恶性肿瘤,约占颅内肿瘤总数的一半。胶质瘤具有手术难以完全切除、放化疗效果不明显、易复发及预后差的特点。MicroRNA (miRNA)是一类通过转录后抑制靶基因表达的非编码小分子RNA。越来越多的研究表明,miRNA广泛调控了恶性肿瘤的多种生物学特性。然而,miRNA在胶质瘤发生发展中的作用研究甚少。因此,研究miRNA在胶质瘤中的作用和机制对于进一步阐释胶质瘤的发病机制以及对于胶质瘤的诊断和治疗具有重要的临床意义。目的：本研究的主要目的是筛选在胶质瘤中具有差异性表达的miRNA;找到几个可能调控胶质瘤生物学特性及抗药性的miRNA;通过生物信息学软件寻找其作用的靶基因并进行相关分子机制研究。方法：(1)根据已报道文献中的miRNA芯片结果,首先找出与正常对照组相比在胶质瘤中表达下调的多种miRNA。然后通过MTT实验筛选能抑制胶质瘤细胞系U87和U251细胞活性的miRNA。通过生物信息学软件miRanda和DIANA microT v3.0进一步寻找筛选后的miRNA可能的调控靶基因。(2)收集武汉大学人民医院2011至2014年手术切除的16例IV级胶质瘤标本。对照来源于8例脑外伤病人所切除的脑组织。然后通过qPCR检测对照脑组织、胶质瘤组织以及U87和U251细胞系中miR-129和miR-873的表达水平。(3)在人胶质瘤细胞系U87和U251中过表达miR-129后,通过MTT法检测细胞增殖；通过流式细胞术检测细胞凋亡；通过qPCR、Western blot、共聚焦、透射电镜以及裸鼠荷瘤实验检测miR-129对U87和U251自噬水平的影响。(4)通过luciferase实验、qPCR和Western blot实验验证miR-129对Notch-1的靶向调控作用。通过qPCR和Western blot检测miR-129对mTOR磷酸化以及E2F7和Beclin-1表达的影响。通过Western blot检测Notch-1对E2F7和Beclin-1表达的影响以及E2F7对Beclin-1表达的影响。(5)构建U87和U251的顺铂耐药株,分别命名为U87/DDP和U251/DDP。通过qPCR找出在顺铂耐药株和野生株中具有表达差异的miRNA。通过MTT法检测miR-873对顺铂耐药株细胞增殖的影响。通过MTT法和平板克隆形成实验检测在顺铂作用下miR-873对细胞活性和细胞增殖的影响；并通过流式细胞术和caspase-3/7活性检测实验检测在顺铂作用下miR-873对细胞凋亡的影响。(6)通过luciferase实验、qPCR和Western blot实验验证miR-873对Bcl-2的靶向调控作用。通过MTT、平板克隆形成实验、流式细胞术和qPCR和caspase-3/7活性检测实验检测Bcl-2在miR-873致胶质瘤细胞顺铂增敏中的介导作用。结果：(1)从多篇已报道文献miRNA芯片结果中找出8个在胶质瘤中表达下调的miRNA,它们分别是miR-128、miR-129、miR-133a、miR-13、miR-153、miR-323、 miR-488和miR-873。MTT实验结果表明miR-129和miR-873能明显抑制U87和U251的细胞活性。通过生物信息学软件miRanda和DIANA microT v3.0预测到miR-129可能调控Notch-1和Bcl-2等多种肿瘤相关基因的表达；并且预测到miR-873可能靶向调控Bcl-2等多种肿瘤相关基因的表达。(2) qPCR检测结果显示：与对照脑组织相比,miR-129和miR-873在胶质瘤组织及细胞系中的表达水平显著降低。(3)过表达miR-129不但抑制U87和U251细胞的增殖和促进其凋亡,还提高了细胞的自噬水平。抑制内源性miR-129的活性可以有效抑制雷帕霉素诱导的细胞自噬水平。裸鼠荷瘤实验结果也表明,注射Lv-miR-129组的裸鼠较注射Lv-NC或PBS组的裸鼠肿瘤体积变小,且肿瘤组织中LC3和Beclin-1水平明显增加。(4) Luciferase实验、qPCR和Western blot实验证实miR-129可以靶向调控Notch-1的表达。另外,miR-129可以通过Notch-1/mTOR或Notch-1/E2F7/Beclin-1两种途径影响胶质瘤细胞的自噬水平。(5)miR-873在U87/DDP和U251/DDP细胞中表达明显下调。过表达miR-873可以抑制U87/DDP和U251/DDP细胞的增殖并且促进其凋亡。在顺铂作用下,miR-873可以增加顺铂对U87/DDP和U251/DDP细胞的杀伤作用。(6)Luciferase实验、qPCR和Western blot实验证实miR-873可以靶向调控Bcl-2的表达。另外,miR-873通过靶向调控Bcl-2增加顺铂对胶质瘤耐药株的杀伤作用。结论：本研究发现,miR-129和miR-873在胶质瘤组织和细胞中表达降低,过表达miR-129或miR-873不但能抑制胶质瘤细胞的增殖还促进其凋亡。另外,miR-129可以通过Notch-1/mTOR或Notch-1/E2F7/Beclin-1两种途径促进胶质瘤细胞的自噬水平。miR-873通过靶向调控Bcl-2增加顺铂对胶质瘤耐药株的杀伤作用。
【图文】：

本作为实验组和８例脑外伤病人所切除的脑组织作为对照组。通过ｑＰＣ民检测逡逑ｍｉＲ－１２９和ｍｉ艮－８巧在胶质瘤和对照脑组织中的表达水平。结果表明，ｍｉＲ－１２９逡逑和ｍｉＲ－８７３在胶质瘤中的表达显著降低（见图１－２和图１－３）。逡逑１４逡逑

再将收集的上清液和５邋ｕｇ／ｍｌ的ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ邋—同加入到Ｕ８７或Ｕ２５１细胞中。逡逑４８小时后分别通过巧光显微镜和流式检测其感染效率。巧光显微镜下观察绝大逡逑部分细胞都发绿光，且流式分析结果提巧感染效率达到９０％Ｗ上（见图２－１邋Ａ和逡逑Ｃ）。接下来用ｑＰＣＲ检测在Ｕ８７和Ｕ２５１中感染Ｌｖ－ＮＣ和Ｌｖ－ｍｉＲ－１２９后ｍｉＲ－１２９逡逑的表达效率。通过对比发现，在感染Ｌｖ－ｍｉＲ－１２９的４８小时后，ｍｉＲ－１２９在两种逡逑细胞系中的表达水平均提高１０００－１５００倍（化图２－１邋Ｂ）。在Ｕ８７细胞中分别转染逡逑ＳＣＲ邋ｓｐｏｎｇｅ和１２９邋ｓｐｏｎｇｅ，邋４８小时后进行（ｉＰＣＲ检测。结果提示，１巧ｓｐｏｎｇｅ逡逑可Ｗ明显抑制ｍｉＲ－１２９的表达，证明１巧ｓｐｏｎｇｅ质粒构建成功（见图２－１邋Ｄ）。逡逑NB逦Ｂ逡逑ＧＦＰ逦Ｆｌｏｃｈｅｓｔ逦Ｍｅｒｇｅ逦｜逦Ｓ：心邋１，，逡逑Ｉ邋ｉｒｌ－ｄｉ逡逑Ｃ逦Ｄ。逡逑心逦ＷＴ逦ＮＣ逦ｍｉＲ－１２９逦｜逡逑ｔＥ迎碰逡逑逦Ｉ：逦ｒ逦Ｉ逦／邋／逡逑ＦＩＴＣ逦争夺４逡逑图２－１在胶质瘤细胞中过表达和拆制ｍ化－１巧的效率。（Ａ）巧光显微镜观察感染Ｌｖ－ＮＣ和逡逑Ｌｖ－ｍｉＲ－１２９的４８小时后的感染效率．（Ｂ）邋ｑＰＣＲ检测感染Ｌｖ－ＮＣ和Ｌｖ－ｍ化－１２９的４８小逡逑时后ｍｉＲ－１２９的表达效率，＊＊Ｐ邋＜邋０．０１。（邋Ｃ邋）流式分析感染Ｌｖ－ＮＣ和Ｌｖ－ｍＵｌ－ｌ巧的４８小逡逑４６逡逑
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41

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本文编号：2520955