Chidamide对急性髓系白血病作用及相关机制的研究

发布时间：2019-08-05 08:24

【摘要】：第一部分Chidamide下调AML SP1/NFκB/DNMT1、FLT3/STAT5表达及-其DNA去甲基化机制研究[目的l：研究HDAC抑制剂Chidamide对AML的抗白血病作用及其DNA去甲基化机制。[方法]：Chidamide 0, 1μM,3μM处理AML细胞MV4-11及Kasumi-1后检测细胞增殖抑制(CCK-8)及流式细胞仪检测细胞凋亡及周期阻滞,同时,Western Blot检测SP1、NFκB、FLT3、STAT5、p-STAT5和DNMT1蛋白表达及组蛋白H3、H4乙酰化水平,实时定量PCR检测DNMT1、P15 mRNA表达,Dotblot测定细胞基因组DNA甲基化水平。Chidamide在体外对患者原代细胞进行处理后应用实时定量PCR及Western Blot检测DNMT1、P15 mRNA水平及DNMT1蛋白水平的表达。[结果l：Chidamide 0、1μM、3μM处理AML细胞MV4-11及Kasumi-1后,出现明显的细胞增殖抑制及细胞凋亡,呈时间、浓度依赖性。药物作用48小时后,细胞周期阻滞于GO/G1期。Chidamide可使MV4-11和Kasumi-1组蛋白H3、H4乙酰化,抑制SP1/NFκB/DNMT1、FLT3/STAT5通路蛋白表达,同时下调DNMT1及上调P15mRNA表达。Chidamide可使MV4-11和Kasumi-1基因组DNA去甲基化。Chidamide在体外处理患者原代细胞后可以降低DNMT1 mRNA及蛋白的表达,上调P15基因的表达。[结论]：Chidamide通过组蛋白H3、H4乙酰化以及抑制SP1/NFκB/DNMT1通路使基因组DNA去甲基化,使AML细胞抑癌基因激活而发挥抗白血病作用；Chidamide下调MV4-11 FLT3/STAT5/p-STAT5通路蛋白表达。Chidamide对于AML尤其FLT3/ITD突变阳性的AML将是一个极有潜力的HDAC抑制剂。第二部分Chidamide对AML1-ETO阳性急性髓系白血病表观遗传学研究[目的]：研究HDAC抑制剂Chidamide对AMLl-ETO阳性AML的细胞和分子作用及其表观遗传学机制。[方法]：Chidamide 0、1μM,3μM处理AML1-ETO阳性细胞Kasumi-1、Skno-1和AML1-ETO阴性细胞U937\Skno-l-si-AE后,检测细胞增殖抑制、细胞凋亡和细胞周期阻滞。同时,Western Blot检测AML1-ETO阳性细胞Kasumi-1、Skno-1组蛋白H3、H4乙酰化水平、DNMT1、DNMT3A、c-KIT、AML1-ETO蛋白表达,实时定量PCR检测DNMT3A、DNMT1、P15基因mRNA的表达。同时检测AML1-ETO阴性细胞U937 DNMT3A、P15蛋白及基因表达。DNA dotblot检测Chidamide对AML1-ETO阳性细胞基因组DNA甲基化影响。将AML1-ETO质粒转染至293T、Scramble和siRNA转染至293T、Kasumi-1和Skno-148小时后检测AML1-ETO和DNMT3A蛋白表达。共转染PGL3-DNMT3A、PCMV-AML1-ETO、PGL3-Basic于293T、 Kasumi-1 6小时后加入Chidamide 3μM,于转染后48小时后荧光素酶活性测定DNMT3A的启动子区活性。[结果]：Chidamide 0, 1μM,3μM处理后,AML1-ETO阳性细胞Kasumi-1、Skno-1细胞增殖抑制及细胞凋亡较AML1-ETO阴性细胞U937、Skno-1-si-AE明显增强。药物作用48小时后,Kasumi-1、Skno-1的细胞周期阻滞于GO/G1期。Chidamide可使Skno-1和Kasumi-1组蛋白H3、H4乙酰化,抑制AML1-ETO、c-KIT、DNMT3A. DNMT1蛋白表达,下调DNMT3A和DNMT1mRNA表达,上调P15mRNA表达,但Chidamide未降低U937 DNMT3A蛋白及mRNA表达。Chidamide可使AML1-ETO阳性细胞基因组DNA去甲基化。在293T、Kasumi-1、Skno-1细胞中,过表达和know down AML1-ETO后,DNMT3A表达相应增加及下降。荧光素酶活性测定显示Chidamide可下调AML1-ETO在DNMT3A启动子区的转录活性。[结论]：作为新一代的HDAC抑制剂,Chidamide可使AML1-ETO阳性细胞组蛋白乙酰化,并通过下调DNMT1、DNMT3A基因组DNA去甲基化,上调抑癌基因表达从而发挥其抑制增殖、诱导凋亡及细胞周期阻滞等抗白血病作用。Chidamide诱导AML1-ETO阳性细胞增殖抑制、细胞凋亡较AML1-ETO阴性细胞更为敏感。Chidamide通过抑制AML1-ETO表达进而下调DNMT3A,但不抑制AML1-ETO阴性细胞DNMT3A的表达,可能使AML1-ETO阳性细胞对Chidamide更为敏感、特异。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.71

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本文编号：2523026